过华蕾， 廖丽贞， 陈燕玲， 吴伟康

(中山大学中山医学院病理生理教研室，广东广州510080)

衰老是一种正常的生物学现象，衰老的过程伴随着氧化损伤的增强，增殖阻滞，端粒酶缩短等。因而随着衰老的发生，各种年龄相关疾病的发病率大大增加，特别是心血管疾病。细胞是组成生物体的基本单位，细胞衰老引起组织器官的功能丧失，最终引致生物的衰老［1－2］。心肌细胞的衰老伴随着心肌收缩力下降，心输出量减少，最终导致心功能障碍，心血管疾病发生。建立细胞水平的衰老模型对于我们研究衰老以及寻找对抗衰老的方法都具有重要意义。目前，细胞水平的衰老模型有体外传代法、肿瘤坏死因子诱导法、过氧化物诱导法、D－半乳糖诱导法等［3］。

细胞外高D－半乳糖环境可以使细胞内半乳糖浓度升高，D－半乳糖在醛糖还原酶的催化下还原成半乳糖醇，这种物质不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀、代谢紊乱、功能丧失，最终引起衰老。此外，D－半乳糖代谢过程中产生的自由基也可以促进衰老的发生。D－半乳糖作为促老剂已在国内外广泛应用，王琳等［3－4］研究发现D－半乳糖对体外原代心肌细胞拟衰老作用，为本实验造模提供了理论依据。Dimri等［5］首次提出β－半乳糖苷酶可作为一种鉴定衰老的生物学指标。近年来，衰老相关的β－半乳糖苷酶染色已成为一个公认指标，广泛应用于衰老的检测。

白藜芦醇(resveratrol)是一种广泛存在于葡萄皮、花生、虎杖、藜芦、决明等植物中的多酚类化合物。它具有许多生物学作用，包括抗癌、保护心血管系统、保护缺血后的脑损伤、调节免疫反应、抗衰老等［6］。然而，白藜芦醇对衰老的原代心肌细胞的效应尚未见报道。本实验采用D－半乳糖建立体外心肌细胞衰老模型，通过衰老、自由基和自噬相关指标的检测，探讨白藜芦醇对衰老心肌细胞影响及其可能的机制。

材料和方法

1 动物

SD乳鼠(出生3 d以内，雌雄不限)，购自中山大学实验动物中心。

2 主要试剂

DMEM(低糖)培养基和M199培养基为杭州吉诺生物公司产品，胎牛血清和马血清为HyClone产品，Ⅱ型胶原酶为Gibco产品。D－半乳糖、荧光素二(β－D－吡喃半乳糖苷)［fluorescein di(β－D－galactopyranoside)，FDG］、噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和单克隆小鼠β－actin抗体均购自Sigma。β－半乳糖苷酶染色试剂盒和微管相关蛋白1轻链3(microtubule－related protein 1 light chain 3，LC3)抗体购自CST。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒和细胞丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。抗鼠及抗兔的连接辣根过氧化物酶的IgG(H+L)购自Vector，超敏发光液(enhanced chemiluminescence，ECL)为普利莱基因技术有限公司产品，显影液和定影液为中科爱比西科技发展有限公司产品。

3 方法

3.1 原代心肌细胞的培养 出生3 d以内的SD大鼠，70%乙醇消毒处死后，用小弯镊取心尖组织，DHanks液洗3次，用弯镊去除心包膜，剪碎，Ⅱ型胶原酶消化数次，每次15 min。收集细胞悬液入皿中，37℃恒温培养箱差速贴壁1.5 h以清除非心肌细胞。收集细胞悬液稀释到3×105，加入10－4mol/L浓度5’－溴脱氧尿嘧啶以抑制成纤维细胞生长，37℃恒温培养箱培养24 h以贴壁。显微镜下可见心肌细胞贴壁融合生长，跳动频率约 90 ～120 min－1［7－8］。

3.2 MTT比色法测细胞活力 将心肌细胞按3×105密度接种到96孔板，每组设5个复孔。待细胞贴壁后按实验分组加入药物处理。48 h后每孔避光加入5 g/L MTT 20 μL，混合均匀后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育4 h后，吸走上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜 DMSO以溶解结晶，摇床振荡10 min，使充分混匀。采用酶标仪测定各孔A(492 nm)值，评价细胞存活率。

3.3 β－半乳糖苷酶染色法 将心肌细胞按3×105密度接种到6孔板，每组设5个复孔。待细胞贴壁后按对照组和衰老组(10 g/L D－半乳糖处理48 h)处理。48 h后吸走培养基，用PBS冲洗2次，室温下用2%甲醛与0.2%戊二醛混合液固定10～15 min。吸走固定液，PBS冲洗2遍。加入含20 g/L X－Gal(X－Gal溶于DMF)的染色液(染色液按照试剂盒说明配成)，无CO2、37℃恒温培养孵育24 h，研究级倒置光学显微镜下可见衰老细胞胞质呈现蓝色，为染色阳性细胞。于倒置显微镜(×200)下拍照，并对视野内染色阳性的细胞计数，每孔3个随机视野，每组设5个复孔。

3.4 FDG法检测β－半乳糖苷酶含量 FDG是一种β－半乳糖苷酶特异性荧光底物，FDG 5 mg溶于38 μL双蒸水与 DMSO混合液中(1∶1)制成200 mmol/L母液(－20℃可保存数月)。将心肌细胞按3×105密度接种到96孔板，每组5个复孔。细胞贴壁后加入药物处理。48 h后吸走培养基，用PBS冲洗2次，室温下用2%甲醛与0.2%戊二醛混合液固定10～15 min。吸走固定液，PBS冲洗2遍。避光每孔加入 100 μL反应液(37 mmol/L柠檬酸，126 mmol/L磷酸氢二钠，5 mmol/L铁氰化钾，5 mmol/L亚铁氰化钾，150 mmol/L氯化钠，2 mmol/L氯化镁)与10 μL 2 mmol/L FDG无CO2、37℃恒温培养孵育24 h，吸取反应液100 μL入96孔黑板，多功能酶标仪读取荧光强度(预读，波段485～535 nm)。此法可半定量地检测β－半乳糖苷酶的含量，作为衰老程度鉴定的指标［9－10］。

3.5 心肌细胞SOD和MDA水平检测 细胞外液SOD和细胞中MDA的水平使用南京建成SOD测定试剂盒(WST－1法)和细胞MDA测定试剂盒进行检测［11］。

3.6 Western blotting检测 将每组蛋白按照总量80 μg计算出上样体积，加入蛋白上样缓冲液，沸水煮5 min后，2 000 r/min离心1 min，然后上样，并加5 μL蛋白marker作为分子量指示。电泳:恒压80 V 30 min，100 V 1 h。电泳完毕后，按“夹心三明治”方式将胶与PVDF膜(使用前在甲醇中浸泡5 s左右)夹在一起，冰浴中恒压100 V 1 h电转。用5%TBST脱脂牛奶溶液将电转后的PVDF膜室温封闭1 h，将含目的条带的PVDF膜浸没在LC3Ⅰ抗滴度均为1∶1 000的5%TBST脱脂牛奶溶液中，4℃摇床孵育过夜。β－actin抗体(1∶10 000)作为内参判断各组间的上样量是否一致。Ⅰ抗孵育完毕后，室温下TBST洗膜5次，每次8 min。加入Ⅱ抗室温孵育1 h。Ⅱ抗滴度均为1∶2 000。Ⅱ抗孵育结束后用TBST洗膜3次，每次10 min。于暗室加上ECL发光液用X胶片曝光，于显影液、定影液中获得显影胶片。X胶片上的目的条带经过扫描仪扫描后，使用ImageJ软件进行条带灰度的半定量分析。

4 统计学处理

用SPSS 13.0统计软件进行分析。数据用均数±标准差(¯x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 心肌细胞衰老模型的建立

D－半乳糖诱导心肌细胞衰老，分别用0.1 g/L、1 g/L、10 g/L和100 g/L浓度处理48 h，用 MTT法测定细胞活力，FDG法检测β－半乳糖苷酶的含量，作为衰老程度鉴定的指标。在10 g/L浓度时，细胞活力没有受到影响，β－半乳糖苷酶含量增加，见表1。再用10 g/L D－半乳糖分别处理12 h、24 h、48和72 h，MTT法检测细胞活力，FDG法检测β－半乳糖苷酶的含量，见表2。在10 g/L D－半乳糖处理48 h这一条件下，心肌细胞活力良好，与对照组比差异没有统计学意义，但β－半乳糖苷酶的含量明显增加，因此选择10 g/L D－半乳糖处理48 h作为心肌细胞衰老造模条件。后面的实验衰老模型组均采用这一条件。

表1 不同浓度D－半乳糖诱导组β－半乳糖苷酶含量及细胞活力的比较Table 1.β－galactosidase level and cell viability in different concentrations of D－galactose treatment groups(¯x±s.n=5)

表2 D－半乳糖诱导不同时间组β－半乳糖苷酶含量及细胞活力的比较Table 2.β－galactosidase level and cell viability in different time of D－galactose treatment groups(¯x±s.n=5)

2 衰老的鉴定

在光学显微镜下对造模成功的细胞进行形态学检查，可以观察到衰老的心肌细胞形状扁平，胞体变大，呈卷帘样变化，跳动频率减慢。β－半乳糖苷酶染色可见对照组仅少量细胞染色阳性(蓝色)，而衰老模型组染色阳性细胞数明显增多，见图1。

3 白藜芦醇对衰老心肌细胞的影响

将细胞分为对照组、衰老组(10 g/L D－半乳糖处理48 h)和白藜芦醇(RESV)处理组(分别以2 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L 和 250 μmol/L 浓度白藜芦醇预处理30 min后加入D－半乳糖，以及白藜芦醇与D－半乳糖同时孵育)，加入FDG，荧光酶标法检测白藜芦醇对衰老心肌细胞的影响，见图2。与衰老组相比，白藜芦醇10 μmol/L及50 μmol/L处理组的β－半乳糖苷酶含量明显减少。预处理组与同时孵育组相比，预处理组没有表现出更强的抗衰老效应。

Figure 1.Identification of D－galactose(10 g/L for 48 h)－induced senescence in cardiomyocytes.A:β－galactosidase staining of cardiomyocytes(×200);B:β－galactosidase－positive cardiomyocyte count;C:beating rate of cardiomyocytes.¯x±s.n=5.*P ＜0.05 vs control group.图1 D－半乳糖诱导的心肌细胞衰老的鉴定

Figure 2.The anti－aging effect of resveratrol(RESV).Senescence－associated β －galactosidase was measured by fluorescence intensity.Cardiomyocytes were pretreated with RESV for 30 min and then subject to D－galactose for 48 h.On the other hand，cardiomyocytes were coincubate with RESV and D －galactose for 48 h.In control and D －galactose groups，cardiomyocytes were treated with vehicle and D －galactose for 48 h，respectively.¯x±s.n=5.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs D －galactose group.图2 白藜芦醇抗衰老效应图

4 白藜芦醇对衰老心肌细胞SOD和MDA水平的影响

将细胞分为对照组、衰老组和白藜芦醇处理组(取对衰老原代心肌细胞有保护作用的10 μmol/L和50 μmol/L的浓度，与D－半乳糖同时加入)，检测细胞外液SOD和细胞中MDA的水平。根据SOD测定试剂盒MDA测定试剂盒操作说明进行检测，可见衰老组SOD水平比对照组降低，而白藜芦醇处理组比衰老组SOD水平显著升高;衰老组MDA水平比对照组升高，而白藜芦醇处理组比衰老组MDA水平显著降低，见表3。

表3 白藜芦醇对衰老心肌细胞SOD活性和MDA含量的影响Table 3.Activity of SOD and MDA level in aging and resveratrol treatment groups(¯x±s.n=5)

5 白藜芦醇对衰老心肌细胞自噬水平的影响

将细胞分为对照组、衰老组、白藜芦醇处理组(取对衰老原代心肌细胞有保护作用的10 μmol/L和50 μmol/L的浓度，与D－半乳糖同时加入)和白藜芦醇空白对照组。刮下细胞，充分裂解后，Western blotting技术检测各组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平，可见衰老组细胞自噬水平下调，而白藜芦醇处理组自噬水平上调，见图3。

Figure 3.Protein level of LC3Ⅱ/LC3Ⅰin aging and resveratrol treatment groups.¯x±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs D － galactose group.图3 白藜芦醇对衰老心肌细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平的影响

讨 论

本实验用D－半乳糖诱导原代心肌细胞衰老，确定了在10 g/L D－半乳糖培养48 h这一条件下，心肌细胞活力没有受到影响，β－半乳糖苷酶含量明显增加。同时发现白藜芦醇在 10 μmol/L和 50 μmol/L的浓度下减少了D－半乳糖诱导的原代心肌细胞β－半乳糖苷酶含量增加的程度。此结果表明在白藜芦醇的作用下，D－半乳糖诱导的发生衰老心肌细胞数明显减少，白藜芦醇对衰老心肌细胞具有保护效应。

SOD能清除细胞中过多的氧自由基，其活力高低可间接反映细胞清除氧自由基的能力;MDA是自由基损伤不饱和脂肪酸生成的中间产物，其含量能间接证明细胞内自由基的水平。细胞内自由基产生增多，而清除自由基的相关酶活性下降，是衰老发生的重要机制［12］。本实验结果表明D－半乳糖作用可使细胞抗氧化能力降低，细胞内自由基含量升高。白藜芦醇具有酚羟基结构，与自由基清除剂维生素E活性结构相似，但其活性明显强于维生素E，具有很强的自由基清除能力和抗脂质过氧化效应。白藜芦醇可以对抗D－半乳糖处理产生的效应，提高SOD水平，降低细胞内MDA含量。由此可以证明，D－半乳糖诱导的心肌细胞衰老与氧化应激损伤和自由基毒性相关。白藜芦醇对抗衰老的效应部分是因为其良好的抗氧化作用改善了细胞的氧化应激状态，提高细胞的抗氧化能力所致［13］。

细胞内损伤物质的积累是所有衰老的普遍特征，导致生命有机体生存能力降低。在衰老过程中，自噬选择性地清除某些细胞成分，如受损或多余的过氧化物酶体和细胞器，维持细胞自我稳态，而一些细胞器经包裹分解后又可以再利用。尽管自噬曾被广泛认为是细胞的一种自我消亡方式［14］。但越来越多的研究结果表明，自噬起的是一种保护细胞的作用，在营养缺乏、缺氧、内质网应激、异常蛋白堆积和DNA损伤的情况下，保存细胞能量，循环利用蛋白和细胞器，增强线粒体功能，防止细胞走向凋亡和坏死。衰老的过程伴随着细胞自噬活动的下调。自噬活动不足促进衰老的发生。自噬活动增强具有抗衰老的作用［15－16］。白藜芦醇作为SIRT1的激活剂，近年来因为其抗衰老的效用而获得广泛关注。白藜芦醇能通过激活SIRT1信号通路来抑制mTOR，上调自噬水平，从而发挥抗衰老作用［17－18］。

衰老是一个正常的生理过程，但各种年龄相关疾病的高发病率使得研究者从未减少对衰老的关注。建立体外心肌细胞衰老模型对观察衰老心肌细胞对外界刺激因素的反应，筛选具备抗衰老效应的药物都具有重大意义。本研究结果为白藜芦醇通过抗氧化应激及上调自噬来对抗衰老提供了实验依据。

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