胡明华，梁永威，彭川丛

(1.无限极＜中国＞有限公司，广东 广州 510665; 2.广州中医药大学，广东 广州 510006)

茯苓为多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，为药食两用的传统中药，在我国分布于吉林、湖北、安徽、云南、四川、浙江、湖南、河南、福建、贵州、台湾、广西等地，生长栽培方式、加工炮制方法、储藏条件等诸多因素会影响其化学成分的含量。茯苓中最主要的化学成分是茯苓多糖，含量可达茯苓干重的84.2%[1]，主要存在于茯苓细胞壁中，按溶解度的不同又分为水溶性茯苓多糖和碱溶性多糖。碱溶性多糖不溶于水，是一种带有(1→6)支链的(1→3)键接的β-D-葡聚糖，经化学改造增加其水溶性后具有显著的抗肿瘤作用[2]。含量较低的水溶性茯苓多糖具有明显的抗肿瘤活性[3]。笔者从产地和规格两方面对茯苓水溶性多糖含量进行研究，比较了不同产地、不同规格茯苓之间的含量差异。现报道如下。

1 仪器与试药

UV-2800型紫外可见分光光度计(尤尼柯＜上海＞仪器有限公司);TL-5.0W型台式离心机(上海市离心机械研究所);PL-303型电子天平(梅特勒-托利多＜上海＞有限公司)。D-无水葡萄糖、浓硫酸、95%乙醇、苯酚均为国产分析纯。各产地和规格的茯苓药材采购于当地，共5个产地3种规格。

2 方法与结果

2.1 多糖含量测定

2.1.1 葡萄糖对照品溶液制备

精密称取干燥至恒重的 D-无水葡萄糖0.010 g，加水溶解，并定容至100 mL，混匀，制成葡萄糖对照品溶液，质量浓度为0.1 g/L。

2.1.2 测定条件优选

测定波长[4-9]:精密吸取葡萄糖对照品溶液1.0 mL和供试品溶液1.0 mL，分别置20 mL试管中，准确补水至2 mL，加入5%苯酚液1.0 mL，在旋转混匀器上混匀，然后迅速加入5 mL浓硫酸，再次混匀后，置沸水浴中煮沸15 min，冷却至室温，在紫外分光光度仪上测定400～520 nm波长之间的吸收度。结果葡萄糖对照品溶液、供试品溶液均在490 nm波长处有最大吸收，故以此为测定波长。

苯酚用量:精密吸取葡萄糖对照品溶液1.0 mL 5份，置20 mL的试管中，准确补水至2 mL，分别加入5%苯酚液0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，在旋转混匀器上混匀后，各加入5 mL浓硫酸，再次混匀，置沸水浴中煮沸15 min，冷却至室温，以纯净水作空白对照，在490 nm波长处测定吸光度。结果当5%苯酚加入量为1.0 mL时，样品的吸光度最大。

浓硫酸用量:精密吸取葡萄糖对照品溶液1.0 mL 5份，置20 mL试管中，准确补水至2 mL，各加入5%苯酚液1.0 mL，在旋转混匀器上混匀后，分别加入浓硫酸 3，4，5，6，7 mL，再次混匀后，置沸水浴中煮沸15 min，冷却至室温，以纯净水作空白对照，在490 nm波长处测定吸光度。结果当浓硫酸加入量为5 mL时，样品的吸光度最大。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察:分别精密吸取葡萄糖对照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置 20 mL 试管中，准确补水至 2 mL，分别加入5%苯酚液1.0 mL，在旋转混匀器上混匀后，加入5 mL浓硫酸，再次混匀，置沸水浴中煮沸15 min，冷却至室温，以试剂空白作对照，在490 nm波长处测定吸光度。以吸光度 A为纵坐标、葡萄糖对照品溶液加入的体积 C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 A=0.698 7 C+0.010 3，R2=0.999 7(n=6)。结果表明，葡萄糖对照溶液加入体积在0.001～0.015 mL范围内与吸光度线性关系良好。

重复性试验:精密吸取供试品溶液1 mL，按含量测定项下方法操作，平行操作6份，以试剂空白作对照，测定吸光度。结果的RSD=0.92%(n=6)，表明方法重复性良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液0.5 mL，按含量测定项下方法操作，以试剂空白作对照，每隔30 min测定1次吸光度，考察样品3 h内的稳定性。结果的 RSD=0.15%，表明供试品溶液在3 h内显色稳定。

精密度试验:精密吸取葡萄糖对照品溶液1 mL，按含量测定项下方法操作，以试剂空白作对照，连续测定5次吸光度。结果的RSD=0.06%，表明仪器精密度良好。

回收率试验:精密吸取供试品溶液0.5 mL，加入葡萄糖对照品溶液0.5 mL，按含量测定项下方法操作，平行操作6份，以试剂空白作对照，测定吸光度。结果平均回收率为94.32%，RSD=0.95%，表明方法准确度良好。

2.2 提取工艺优选

2.2.1 供试品溶液制备

分别取每个产地的3种不同规格茯苓等量混合粉碎，过60目筛，称取10 g茯苓粉，按正交表设计的条件进行提取，趁热用滤布过滤，滤渣用少量热水洗涤，合并滤液，用大容量的离心机离心(3 000 r/min，10 min)，取上清液，浓缩至 10 mL，加入 95% 乙醇50 mL，醇沉浓度为80%，放置过夜;离心(4 000 r/min，15 min)，去掉上清液，沉淀用80%乙醇洗涤两次，每次约15 mL，离心，倾去上清液;沉淀加入2 mol/L硫酸溶液5 mL，搅拌使其溶解，转移至200 mL烧杯中，并加入约100 mL水，加热至沸腾，使沉淀彻底溶解，冷却后加水定容至500 mL，用小瓶留样，备用，得供试品溶液。

2.2.2 含量测定

分别取1 mL供试品溶液，按线性关系考察项下方法操作，测定吸光度，计算含量。

2.2.3 正交试验与结果

本试验选取4个主要因素，因素A为第1次煎煮时间，因素B为第1次加水量，因素C为第2次煎煮时间，因素D为第2次加水量。每个因素拟2个水平，选用 L8(27)表进行正交试验。因素水平见表1，正试验结果见表2，方差分析见表3。由表2和表3可知，最优的提取条件为A2B2C1D2，即第1次加水20倍，第1次煎煮2h，第2次加水15倍，第2次煎煮1h。

表1 因素水平表

表2 正交试验结果

2.3 茯苓水溶性多糖制备

2.3.1 不同产地茯苓水溶性多糖

分别取每个产地3种不同规格的茯苓，等量混合粉碎，过60目筛，称取20 g粉末(平行操作3份)，按最优条件进行提取，即第1次加入20倍水(400 mL)煎煮2 h，过滤后，滤渣再加入15倍水，煎煮1 h。按2.2.1项下供试品溶液制备方法制得溶液。

表3 方差分析

2.3.2 不同规格茯苓水溶性多糖

取湖南产地的茯苓药材块、丁和片，其中块平均为5.0 cm×3.2 cm×0.8 cm，丁平均为0.8 cm×0.8 cm×0.6 cm，片平均为3.5 cm×1.1 cm×0.1 cm。分别取上述药材20 g(平行操作3份)，按2.3.1项下方法提取、溶解，定容至500 mL。

2.4 茯苓水溶性多糖测定

分别取各产地和规格的供试品溶液1 mL(茯苓片取0.5 mL)，按2.1.3项下方法进行操作，测定吸光度。结果见表4和表5。可见，湖北产地的茯苓水溶性多糖提取率最高，云南产地的茯苓水溶性多糖提取率最低;茯苓片的茯苓水溶性多糖提取率最高，块的提取率最低。

表4 不同产地茯苓多糖含量测定结果

表5 不同规格茯苓多糖含量测定结果

3 讨论

本试验结果显示，各产地中茯苓水溶性多糖的提取率最高为湖北(0.431%)，其他依次为浙江、安徽、湖南、云南;在不同规格的茯苓中，茯苓片的多糖提取率明显高于茯苓块和丁，这可能是由于茯苓片得表面积较大，有利于水溶性多糖的溶出。这些结果为茯苓药材的质量评价和开发利用奠定了一定基础。

硫酸-苯酚比色法是测定多糖含量较经典有效的方法之一[5]。本试验结果表明，该法用于茯苓多糖的测定时，供试品溶液3 h内显色稳定，结果可靠。

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