李静红，武立刚，周亚丹，崔 颖，李桂秋

（1.齐齐哈尔医学院附属三院，黑龙江 齐齐哈尔161000；2.哈尔滨医科大学第一临床医学院 微生物科）

RNA干扰是细胞利用21－23nt双链RNA介导的转录后同源m RNA沉默的现象［1］。由于具有高度特异性和有效性，RNA干扰被广泛用于HIV、HCV、流感病毒等功能性基因的研究中。基于逆转录环节在HBV复制中的重要作用，一些学者已经证实RNA干扰可以通过沉默病毒基因来抑制HBV复制［2，3］，这为抗 HBV 慢性感染提供了一种新的方法。我们曾经报道过针对HBV核定位信号区的小干扰RNA（siRNA）能够有效抑制 HBV DNA复制和ccc DNA扩增［4］。因为 HBV感染是多基因参与的细胞内感染过程，我们认为联合使用siRNA能够发挥更强的抗HBV作用。在本实验中，我们在Hep G2.2.15细胞中联合应用siRNA来抑制HBV复制。实验结果表明联合应用siRNA比单独应用siRNA产生更强烈的抑制HBV复制作用，特别是对cccDNA的抑制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 （DMEM）和G418购自美国GIBCO公司。Hep G2.2.15细胞为本实验室保存。质粒psi／U6由武汉晶赛公司提供。PCR引物由上海博雅 生物公司合成。Trizol，M－MLV 逆转录酶，Lipofection 2000购自美国Invitrogen公司。所用限制性内切酶购自NEB公司。

1.2 构建质粒表达载体 我们在质粒psil／U6的Bam HⅠ－HindⅢ位点之间插入一段21nt的编码相应siRNA的特异序列构建了HBVsiRNA的表达载体，并进一步通过BLAST分析为未发现同源序列。引物序列如下：siRNA1：5’－AAGATCTCAATCTCGGGAATC－3’；siRNA2：5’－CAGGTCCCCTAGAAGAAGAAC－3’；无关对照质粒HK：5’－ACTACCGTTGTTATAGGTG－3’。重组质粒通过酶切和DNA序列分析加以鉴定。

1.3 细胞培养和转染 Hep G2 2.2.15细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中（含青霉素100 U／ml，链霉素100μg／ml，200μg／ml G418），37℃ ，体积分数为5%CO2的孵箱中培养。转染前24小时将细胞置于6孔板培养，4μg表达相应siRNA的质粒与脂质体Lipofectamine 2000按说明书步骤共转染，每24小时更换培养液，分别于48、72、96小时收集细胞做进一步分析，实验分为5组，每组设3个复孔。……