郭幻，姚俊，蔡珉敏，王静伟

（北京科技大学土木与环境工程学院环境工程系／国家环境与能源国际科技合作基地，北京100083）

苯系化合物是石油烃中易挥发的一类单环芳香烃化合物，简称BTEX，广泛应用于石油、化工、农药、纺织、造纸、油漆、制鞋等生产过程，具有强致癌性，已被许多国家列为优先控制的污染物［1］。

BTEX污染的治理技术按照机理不同可分为物理法、化学法和生物法，其中，生物降解具有能耗低、操作简单、处理效果好等优点，是这类污染物的主要处理技术之一。Alexander和 Bordelon研究［2－3］表明，在微生物降解多环芳烃和煤焦油的过程中，毒性较低的物质被降解后所产生的代谢产物毒性反而增加，且由于多种代谢物之间复杂的相互作用，这些污染物降解之后的底物甚至具有更强的致癌性。因此，在BTEX生物降解过程中，除了监测其量的去除，还必须对不同降解程度混合物的毒性进行研究。

细胞在生长代谢过程中，有一部分能量会以热的形式散发出来，应用微量热技术可以监测这种能量的变化，获得每个细胞生长代谢的热输出动态曲线。通过研究细胞在有毒物质存在时热输出动态曲线的变化，可以检测有毒物质对细胞生长代谢的影响。这种技术具有灵敏度高、准确、快捷、原位、可提供实时的定量数据、直观性强等优点，已广泛应用于研究重金属、杀虫剂对生物的毒性［4－5］。

枯草芽孢杆菌为广泛分布于环境的革兰氏阳性细菌，是研究环境中污染物毒性的代表性微生物［6－7］。因此，本文应用微量热技术探究不同生物降解程度下BTEX混合物对该菌代谢放热速率的影响，从能量代谢角度分析生物降解技术降低BTEX毒性的有效性，为该技术实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂和菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）由武汉华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供。

苯、甲苯、乙苯、二甲苯为分析纯级。

毒性评价使用LB液体培养基，成分为：10.0 g／L 蛋白胨，5.0g／L 酵母膏，10.0g／L NaCl，1000 mL去离子水。

菌株降解性能评价使用液体无机盐培养基，成分为：1.0g／L NaCl，0.7g／L MgSO4·7H2O，1.0 g／L NH4Cl，0.7g／L KCl，2.0g／L KH2PO4，3.0 g／L Na2HPO4，0.02mg／L CaCl2，0.5mg／L FeCl3·6H2O，0.005mg／L CuSO4，0.005mg／L MnCl2·4H2O，0.1mg／L ZnSO4·7H2O，1000mL去离子水。所用培养基于121oC，0.1MPa下灭菌30min。

1.2 BTEX降解菌的分离与鉴定

按照文献［8］中富集和分离石油烃降解菌的方法，从天津大港油田的石油污染土壤中筛选出1株BTEX降解菌。降解菌DNA的提取和纯化采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒（V 2.2，上海申能博彩生物科技有限公司），选用细菌通用引物Uni－27F和 Uni－1492R［9］对16SrRNA 进行PCR扩增，引物合成由宝生物工程有限公司完成。PCR产物测序由北京三博远志生物技术有限公司完成，将测序结果同GenBank中的基因序列进行同源性比较分析，选取1400bp左右长度进行对比（CLUSTAL W），采用邻位连接（neighbor－joining）法进行系统学分析（MEGA 4），确定菌株的种属。

1.3 菌株的生理生化分析

其生理生化实验参照《常见细菌系统鉴定手册》。

1.4 菌液的制备

将BTEX降解菌ustb－1和枯草芽孢杆菌均接种至LB液体培养基中，待菌株生长到对数期，取菌液离心（8900r／min，10min），将收集的菌体用灭菌后的去离子水清洗3次，然后溶解到液体无机盐培养基中，使菌液的OD600＝0.5。2种菌株的菌液分别用于研究BTEX降解的特性和降解前后毒性的变化。

1.5 菌株ustb－1降解BTEX的特性

在300mL锥形瓶中加入100mL液体无机盐培养基和1mL 1.4中制备的BTEX降解菌ustb－1的菌液，再分别加入100μL苯、50μL甲苯、10μL乙苯、10μL二甲苯，锥形瓶瓶口使用丁基橡胶塞密封，并用铝冒将胶塞固定，以防止实验过程中苯系物的挥发。锥形瓶放置在摇床中，28℃，180r／min恒温培养96h，每隔12h取样测量菌液浓度，每隔24 h取样测量锥形瓶中苯系物的浓度。

BTEX混合物的总降解率的计算参照文献［1］。

1.6 BTEX混合物的毒性研究

采用美国TA仪器公司的TAM III型微量量热仪研究不同降解程度BTEX混合物对枯草芽孢杆菌代谢放热的影响，该仪器灵敏度为10nW。

将灭菌后的2mL液体LB培养基加入到灭菌后的4.5mL不锈钢安培瓶中，再加入20μL 1.3中制备的枯草芽孢杆菌菌液待用。将经过菌株ustb－1降解后的BTEX混合物（每24h取一次样）经0.2 μm有机滤膜过滤后，取200μL分别加入到装有枯草芽孢杆菌的安培瓶中。安培瓶中含有枯草芽孢杆菌菌液而不添加降解后的BTEX混合物为空白。将安培瓶放置在微量量热计的监测位置，控制仪器温度为28oC，平衡后仪器自动记录枯草芽孢杆菌生长周期的热输出动态曲线。

枯草芽孢杆菌生长过程中的总放热量（Qtotal，J）通过对热输出动态曲线积分得到。微生物在生长对数期的热量输出与时间的关系可由公式（1）表示，即

式（1）中pt是微生物在对数期t时刻的热输出，p0是微生物在对数期开始时的热输出。

比生长速率（μ，h－1）可按式（1）对热输出动态曲线中对数生长期某一时刻t的热输出值对数lnpt和时间t进行线性拟合得到。微生物生长过程中的最大热输出pmax（μW）和出现最大热输出的时刻tmax（min）可从热输出动态曲线中直接获得。

BTEX混合物对枯草芽孢杆菌比生长速率μ的抑制率（I）可由式（2）计算得到

式（2）中，μ0和μc分别为枯草芽孢杆菌在空白组和BTEX混合物存在时的比生长速率。

1.7 分析方法

（1）采用文献［10］的方法进行样品预处理，用岛津公司GC－MS（QP2010SE）进行苯系物的定量，色谱柱为RXI－5MS毛细管柱（30m×0.25mm×0.25 μm）；GC／MS参数设置如下：柱温箱40oC，进样口290oC，分流比20／1，离子源200oC，接口230oC；升温程序为：40oC，2min；40～70oC，25oC／min；70～80oC，2oC／min；80～250oC，25oC／min。

（2）菌液浓度（OD600）测量使用岛津公司紫外可见分光光度计（UV－1800）。

2 结果与分析

2.1 BTEX降解菌的鉴定

以天津大港油田被原油污染的土壤为菌源，经过富集筛选得到1株BTEX降解菌，编号为ustb－1（Genbank登录号是JN235141）。菌株ustb－1革兰氏染色、孢子产生、过氧化氢酶、硝酸盐还原、H2S、柠檬酸盐利用、接触酶等实验为阳性，氧化酶、乙酰甲基甲醇、淀粉水解、吲哚、甲基红、荧光色素等实验为阴性。该菌株菌落形态为圆形，乳黄色，半透明，边缘整齐，光滑湿润，在LB液体培养基中的最适生长温度为28oC。

菌株ustb－1的系统发育树如图1所示。

图1显示：该菌与模式菌株Rhodococcus DSM 43066T（X79289）的相似度为100%，可以推断菌株ustb－1属于Rhodococcus属。

图1 菌株ustb－1与Rhodococcus sp中典型菌株的系统发育树图Fig.1 Neighbor－Joining phylogenetic trees based on 16SrRNA gene sequences of strain ustb－1 and other closely related strains

2.2 Rhodococcus sp.ustb－1对 BTEX的降解特性

BTEX混合物降解过程中总浓度变化和降解菌生长情况如图2所示。

图2 BTEX降解过程中总浓度变化及降解菌生长情况Fig.2 BTEX compounds and biomass concentrations in aqueous phase during biodegradation

图2显示：实验开始后的24h内BTEX混合物浓度变化不大，总的降解效率较低，这是因为此时降解菌Rhodococcus sp.ustb－1处于对BTEX的适应期，其生长缓慢，活性较低且数量增加缓慢。24h后，Rhodococcus sp.ustb－1生长增速，进入对数增长期，BTEX浓度迅速降低，降解程度明显增加，至48、72、96h时BTEX混合物的总降解效率分别达42.61%、79.63%、99.63%。

在BTEX 总浓度达1432.88mg／L，即接近BTEX在水中的饱和溶解度时，Rhodococcus sp.ustb－1仍可以高效降解BTEX类物质。生物降解技术去除挥发性有机污染物的效果是由这类污染物的毒性决定的，一般情况下生物降解的周期较长，并且要求底物的浓度不能太高。但是Rhodococcus sp.ustb－1在BTEX几近水体饱和的情况下，依然有很高的活性，在96h内对其降解程度达到99.63%，这表明其具有高效降解水体中BTEX类污染物的能力。

2.3 不同降解程度的BTEX混合物对枯草芽孢杆菌代谢放热的影响

在不同降解程度的BTEX混合物存在时，枯草芽孢杆菌生长周期的热输出动态曲线如图3所示。

图3 枯草芽孢杆菌在不同降解程度BTEX混合物存在时的生长代谢热输出动态曲线Fig.3 The power－time curves of B.Subtilis growth at different degradation extent of BTEX compounds in LB medium

图3显示：微生物生长的适应期、对数期、稳定期和衰亡期。与空白比较可知，不同降解程度的BTEX混合物对微生物的生长有明显的抑制，但是随着降解时间的增加，BTEX混合物对微生物的抑制作用明显降低。

为了定量分析不同降解程度BTEX混合物的毒性，运用软件Origin 8.0计算出每一条热输出动态曲线所对应的μ、Qtotal、pmax和tmax，结果见表1。

由表1可知：μ随着BTEX浓度降低而增加，这与文献［11］的研究结果一致。这是因为BTEX混合物对微生物的毒性作用机制包括改变微生物细胞膜的渗透性和细胞的结构，使功能蛋白失活，降低微生物的代谢活性。μ随着降解程度的加强而增加说明降解后的BTEX混合物对微生物的毒性降低。

Qtotal随着降解程度的增加而增加也说明生物降解能够有效降低BTEX混合物的毒性。但是，在降解96h后的BTEX混合物存在时，微生物的Qtotal为10.52J，大于空白的Qtotal（9.56J）。该结果与文献［12－13］的结果一致，这是因为96h后，99.63%的BTEX被除去，在低浓度的BTEX混合物存在下，微生物细胞通过细胞结构和功能的适当改变，适应了这种压力，从而具有更高的活性，因此生长过程中将释放更多的热量。此外，pmax随着降解时间的增加而增加，tmax随着降解时间的增加而减少，这些参数的变化趋势都表明随着降解程度的增加，BTEX混合物对微生物的毒性逐渐降低，同时由图3可知，以枯草芽孢杆菌为目标微生物，利用微量热技术监测有机污染物生物降解过程中的毒性具有良好的应用前景。

2.4 Rhodococcus sp.ustb－1 的降解作用降低BTEX毒性的有效性

不同降解程度的BTEX混合物对枯草芽孢杆菌的抑制率见表1。

表1 枯草芽孢杆菌在28℃下生长代谢放热参数Tab.1 Calorimetric parameters of B.subtilis growth obtained from microcalorimetry at 28℃

由表1可知：降解开始24h时为84.70%，48h为75.03%，72h为45.72%，96h为17.03%。

抑制率与降解率的关系如图4所示。

图4显示：BTEX对微生物的毒性随着降解程度的增加而降低。但降解率从8.14%增至42.61%时，抑制率从84.70%降低到75.03%，并没有发生相同程度的降低，而从48h之后，随着降解程度的增加，抑制率才开始明显降低。这是因为生物降解具有延迟性，在降解过程开始时，虽然底物被去除，但是降解过程中间产物也具有毒性，所以抑制率并没有明显的下降，而是随着降解时间的增加，降解程度增强，部分中间产物也被降解，抑制率才出现明显的下降。

经过 Rhodococcus sp.ustb－1 降 解 96h 后，99.63%的BTEX被除去，但是，降解之后的底物对枯草芽孢杆菌仍有17.03%的抑制率。在Nunes－Halldorson等［14］的研究中，甲苯被微生物完全降解之后，其代谢产物依然能造成网纹水蚤24%的死亡率，虽然较降解前33%的死亡率有所下降，但依然有明显的毒性存在。这可能是由于生物降解过程中有毒的中间产物和终产物的存在导致的结果。例如，邻苯二酚是苯系物生物降解过程的中间产物，已经有研究表明其对微生物的毒性比苯系物大。

图4 BTEX混合物降解程度与其毒性之间的关系Fig.4 The relation of degradation extent and toxicity of BTEX compound

3 结论

（1）从天津大港油田石油烃污染的土壤中，筛选出一株能高效降解BTEX的菌株ustb－1，经鉴定为Rhodococcus属。

（2）BTEX 初 始 浓 度 为 1432.88mg／L 时，Rhodococcus sp.ustb－1在96h内对其降解程度达到99.63%；初始浓度为1432.88mg／L的 BTEX混合物经Rhodococcus sp.ustb－1降解96h之后，对枯草芽孢杆菌比生长速率的抑制率从84.70%降低到17.03%，有效降低了BTEX混合物的毒性。

（3）99.63%的BTEX被降解后对枯草芽孢杆菌比生长速率依然有明显的抑制，需要进一步针对生物降解之后残余毒性存在的原因进行研究。

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