高君 王志华 于德水 辛颖 丁颖

我们对A-NK及NA-NK细胞体外扩增情况进行观察，然后用A-NK/IL-2局部或全身应用进行体内的抗肿瘤治疗实验，并与NA-NK进行了比较。结果局部应用A-NK/IL-2治疗比NA-NK/IL-2有更强的抑瘤作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和培养液

1.1.1 完全培养液(CM) 分离制备的A-NK和NA-NK细胞均采用RPMI-1640完全培养液培养。

1.1.2 重组IL-2 南京军事医学研究所研制10万IU/2 ml所用25 cm2和75 cm2培养瓶和培养板均为美国Costar产品。

1.2 肿瘤细胞 恶性纤维肉瘤S180(腹水型)，由本实验室反复传代而建立，皮下接种于昆明纯系小白鼠;

1.3 实验动物 昆明纯系小白鼠，本研究所动物室传代和繁殖，6～8周龄雌性，平均体重16～18 g;严格按照国际标准进行饲养和实验操作。

1.4 小鼠脾细胞分离和制备A-NK和NA-NK细胞 按照Hegenaars 98年的方法，无菌取鼠脾，过200目钢网，研磨成单细胞悬液，将所得单细胞悬液加入尼龙毛柱中，在37℃5%C02培养箱中孵育45 min，以去除B细胞和单核巨噬细胞。用预温37℃的完全培养液轻轻冲洗尼龙毛柱，收集未粘附尼龙毛的细胞，用完全培养液调成2×106/ml，置于塑料培养瓶中水平培养24 h后，移去含未粘附塑料表面的细胞悬液(此即NA-NK细胞)，收集粘附于塑料表面的细胞(即A-NK细胞)，二者分别重悬于含50%自体条件培养基的完全培养液中，继续培养扩增。

1.5 细胞体外扩增情况的观察 将A-NK或NA-NK细胞以1×106/ml的深度加入6孔板，2 ml/孔，设三个复孔，定期换液，每隔三天计数一次，取三孔均值。

以0.4%台盼兰(Trypan Blue)活细胞计数法计数细胞数量，以1:l比例将台盼兰与单个细胞悬液混和，室温中放置2 min，加入到细胞计数板中，镜下观察细胞活力和进行细胞计数，活细胞不着色，死细胞染成兰色。……