胡 筱，李春阳，周 涛，*

（1.南京师范大学金陵女子学院，江苏南京210097; 2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京 210014）

响应面法优化蓝莓叶抑菌物质的提取工艺

胡 筱1，李春阳2，周 涛1，*

（1.南京师范大学金陵女子学院，江苏南京210097; 2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京 210014）

在单因素实验基础上，采用响应面法优化蓝莓叶抑菌物质的最佳提取工艺，实验结果为:乙醇体积分数85.00%、提取温度66℃、液料比9.2∶1（mL/g），在此条件下蓝莓叶提取物抑菌效果最好，抑菌圈直径平均值达18.07mm。

响应面法，蓝莓叶，抑菌，提取工艺

蓝莓，又称越橘，属杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium spp.）多年生落叶或常绿灌木［1］。分布于中国、俄罗斯、欧洲、北美、日本、朝鲜等北半球高纬度国家［2］。蓝莓作为一种药食两用植物，以叶入药，性温、味苦，有利尿、消炎、解毒之功效，并可用于风湿、痛风的治疗。蓝莓叶中含有丰富的黄酮类、原花青素、花色苷类等多种多酚类生理活性成分，还富含多种微量元素［3］。植物多酚能与生物大分子如蛋白质、多糖结合，并能与金属离子发生络合反应，对微生物具有抑制作用［4］。对于蓝莓的研究，大多局限于对其果实营养成分、药用成分的测定，而对蓝莓叶的应用和研究较少。目前国内外对蓝莓叶的研究主要集中在活性物质的提取纯化、黑色素的稳定性及其生理功能［5－10］方面，对于蓝莓叶提取物抑菌作用的研究较少。本实验采用响应面法（RSM）［11］优化蓝莓叶抑菌物质的提取工艺，旨在为蓝莓叶资源的利用及天然抑菌剂的开发提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝莓叶 采自南京市溧水傅家边农业科技观光园;大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus） 南京师范大学食品微生物实验室;培养基 牛肉膏蛋白胨培养基;无水乙醇、氢氧化钠、琼脂、氯化钠 均为分析纯;牛肉膏、蛋白胨 均为生化试剂。

YXQ－LS－SII型高压灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;LD5－10型低速离心机 北京医用离心机厂;N－1001型旋转蒸发仪 上海爱郎仪器有限公司;SW－CJ－IF型无菌超净工作台 苏州净化设备有限公司;DHG－9140型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司;CHA－S气浴恒温振荡培养箱 苏州江东精密仪器有限公司;722N可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓叶提取物的制备 蓝莓叶经60℃干燥后粉碎过筛，称取蓝莓叶粉末5g，加入提取剂，在一定温度下冷凝回流，真空抽滤，4000r/min离心8min，取上清液旋转蒸发浓缩至5m L原液（此处原液指1m L提取液中含有1g原材料的提取物，即1g/m L），原液经0.2μm微孔除菌膜过滤除菌后，4℃条件下保存备用。

1.2.2 菌悬液的制备 在无菌条件下，将供试菌种接种到牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，37℃培养24h，挑取菌落，用无菌生理盐水稀释，获得6～7 lgCFU/m L的菌悬液，备用［12］。

1.2.3 提取物抑菌作用的测定 采用打孔法测定提取液抑菌作用。吸取适宜体积分数的菌悬液0.1m L加入平皿中，倒入温度冷却至50℃左右的培养基约15m L后摇匀;待培养基凝固后，用打孔器在平板上打出三个直径为6mm的圆孔，向圆孔中加入50μL提取液，每个菌种每种提取物做三组平行，另以试样含同样体积分数的乙醇为空白对照。平皿放置于37℃下培养24h后，用游标卡尺量取抑菌圈直径，以抑菌圈直径大小作为衡量提取液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌活性的指标。

1.2.4 单因素实验 以两种菌种抑菌圈直径的平均值为指标，研究乙醇体积分数、提取温度、液料比和提取时间四个因素的影响规律。

1.2.5 响应面实验方案 根据单因素实验结果设定因素水平，采用 Design Expert 7.0软件的 Box－Behnken实验设计原理［13］，选取影响抑菌物质提取率的3个主要因素:乙醇体积分数、提取温度和液料比进行响应面优化组合，因素水平设计见表1。

表1 Box－Behnken实验设计因素水平及编码Table 1 Factors and coded levels in the Box－Behnken experimental design

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇体积分数对提取物抑菌效果的影响 在液料比10∶1（m L/g），温度60℃，时间6h的提取条件下，随着乙醇体积分数的提高，蓝莓叶抑菌物质的提取率也随之增大。但当乙醇体积分数达到80%以上时，抑菌效果随乙醇体积分数的增加而减弱（见图1）。这可能是由于一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分增大溶出，干扰因素增大，从而导致抑菌物质的提取率下降。

2.1.2 提取温度对提取物抑菌效果的影响 在液料比10∶1（m L/g），乙醇体积分数80%，时间6h的提取条件下，随着提取温度的升高，蓝莓叶抑菌物质的提取率先增后减（见图2）。在温度60℃时，提取物的抑菌活性达到最高值，继续增加提取温度，抑菌活性反而下降。温度过高，活性物质的结构会遭到破坏;另一方面也会造成溶剂的损失和成本费用增加。

图1 乙醇体积分数对抑菌效果的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on antibacterial activity of the extract

图2 提取温度对抑菌效果的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on antibacterial activity of the extract

2.1.3 液料比对提取物抑菌效果的影响 在乙醇体积分数80%，温度60℃，时间6h的提取条件下，随着液料比的升高，蓝莓叶抑菌物质的提取率也随之增大（见图3）。液料比10∶1（m L/g）时，蓝莓叶提取物的抑菌活性最强。继续增大液料比，抑菌活性变化不大。前期溶剂量大，可以增加物料与溶剂的接触面积，有效成分浸出更加完全，当液料比达到一定的比例时，提取剂中抑菌物质的溶解度基本达到饱和，此时再增大液料比会造成溶剂和能源的浪费，并使进一步的浓缩时消耗更多的能量和时间。

图3 液料比对抑菌效果的影响Fig.3 Effect ofmaterial－to－liquid ratio on antibacterial activity of the extract

2.1.4 提取时间对提取物抑菌效果的影响 在液料比10∶1（m L/g），乙醇体积分数80%，温度60℃的提取条件下，随着提取时间的增加，蓝莓叶抑菌物质的提取率也随着增大（见图4）。但当提取时间达到6h以上时，抑菌效果随提取时间的增加而减弱。表明提取时间在1～6h时，物料与溶剂接触越来越充分，体积分数差也较大，扩散速度快，加速了有效抑菌成分的浸出［14］。随着时间延长，增加了非抑菌成分的浸出，同时抑菌成分可能也受到了破坏。

表3 回归模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

图4 提取时间对抑菌效果的影响Fig.4 Effect of extraction time on antibacterial activity of the extract

2.2 响应面优化实验

2.2.1 响应面设计结果与分析 按表1因素与水平设计实验方案，实验结果见表2。

表2 响应面法设计与实验结果Table 2 Experimental design and results of the Box－Benhnken test

2.2.2 回归模型的建立及其显著性检验 利用Design－Expert 7.0软件对表2数据进行多元回归拟合，得到乙醇体积分数（X1）、提取温度（X2）、液料比（X3）的二次多项回归模型:

对该模型进行方差分析，结果见表3，回归模型系数显著性检验，结果见表4。

从表3可见，对蓝莓叶抑菌物质提取所建立的回归模型差异极显著（P＜0.0001），说明该回归方程因变量和全体自变量的相关关系是显著的，即这种实验方法是可靠的。失拟项P＞0.05，差异不显著，说明可以用该回归方程对不同提取条件下的抑菌物质的提取效果进行检测。复相关系数R2=0.9772，说明该模型能解释97.72%响应者的变化，即该模型与实际实验拟合良好，实验误差小。校正决定系数R2Adj=0.9478，说明该回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。另外，该模型的变异系数为1.50%，数值较低，说明该实验重复性好［15］，可靠性强。该模型的RSN（信噪比）为17.568，远大于4，说明用此模型可以得到足够强的响应信号。由此可知，回归方程的拟合度和可信度均很高，能够很好地对蓝莓叶中抑菌物质的提取进行预测。

由表4可以看出，乙醇体积分数和提取温度的交互作用、提取温度的二次项和液料比的二次项对抑菌效果有极显著影响（P＜0.01）;乙醇体积分数、提取温度和液料比的一次项以及提取温度和液料比的交互作用对抑菌效果有显著影响;乙醇体积分数和提取温度的交互作用、乙醇体积分数的二次项影响不显著。表明乙醇体积分数、提取温度和液料比对蓝莓叶抑菌物质的提取影响显著，并且乙醇体积分数和提取温度、提取温度和液料比之间存在交互作用。由3个因素的F值大小可知，对蓝莓叶抑菌物质的提取效果影响的显著性顺序依次为液料比＞提取温度＞乙醇体积分数。

2.2.3 响应面分析与优化 根据回归模型作出两因素交互作用的响应曲面及其等高线图，结果见图5～图7。如果一个响应曲面坡度非常陡峭，表示响应值对于各实验表件改变很敏感［16］。

图5显示在液料比为10∶1条件下，提取温度和乙醇体积分数对蓝莓叶抑菌物质提取的影响。提取温度对抑菌物质提取的影响显著，曲面较陡，乙醇体积分数对抑菌物质提取的影响不太显著，曲面相对较缓和。图6显示在提取温度为60℃条件下，液料比和乙醇体积分数对蓝莓叶抑菌物质提取的影响。液料比对抑菌物质提取的影响显著，曲面较陡，乙醇体积分数对抑菌物质的影响不太显著，曲面相对较缓和。图7显示在乙醇体积分数为80%条件下，液料比和提取温度对蓝莓叶抑菌物质提取的影响。液料比和提取温度对抑菌物质提取的影响均显著，曲面都较陡。

表4 回归模型系数的显著性检验结果Table 4 Test results of significance for regression coefficient

图5 提取温度和乙醇体积分数交互作用对抑菌效果影响的响应面图Fig.5 Response surface graph indicating the effects of extraction temperature，ethanol concentration and their interactions on antibacterial activity of extract

图6 液料比和乙醇体积分数交互作用对抑菌效果影响的响应面图Fig.6 Response surface graph indicating the effects of material－to－liquid ratio，ethanol concentration and their interactions on antibacterial activity of extract

2.2.4 回归方程及模型验证 对回归方程取一阶偏导数等于零，整理得如下:

由式（1）～式（3）联立解方程组，换算成实验条件得到乙醇体积分数X1=85.00%，提取温度X2= 65.83℃，液料比X3=9.18∶1。在此条件下，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌圈直径可达18.13mm。考虑实际情况将最佳工艺条件修正为乙醇体积分数85.00%，提取温度66℃，液料比9.2∶1，重复实验3次，实际测得的抑菌圈直径为18.07mm，与理论预测值相比，其相对误差约为1%，说明该模型准确可靠，具有实用价值。

图7 液料比和提取温度交互作用对抑菌效果影响的响应面图Fig.7 Response surface graph indicating the effects of material－to－liquid ratio，extraction temperature and their interactions on antibacterial activity of extract

3 结论

蓝莓叶抑菌物质的最佳提取工艺参数为:乙醇体积分数85.00%，提取温度66℃，液料比9.2∶1，提取时间6h。此时，蓝莓叶中抑菌物质提取效果最佳，抑菌圈直径可达18.07mm，与模型预测值接近。本研究为蓝莓叶资源的综合利用和天然抑菌剂的开发奠定了基础，具有重要的现实意义。

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Optim ization of extraction technology of antim icrobial substances from blueberry leaves by response surface analysis

HU Xiao1，LIChun－yang2，ZHOU Tao1，*

（1.Ginling College，Nanjing Normal University，Nanjing 210097，China; 2.Institute of Agro－food Science and Technology，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China）

In order to ob tain op timum cond itions for extrac tion of antibac terial substance from b lueberry leaves，on the basis of sing le factor investigations，response surface methodology（RSM）was used to study effec ts of ethanol concentration，extrac tion tim e and solid－liquid ratio on the extraction rate of antim ic robial substances.Results showed that the op timum cond itions were as follows:ethanol concentration 85.00%，extraction temperature 66℃and liquid－to－material ratio 9.2∶1（m L/g）.Under the op tim ized cond itions，the maximum d iameter of inhibition zone was 18.07mm.

response surface m ethodology;b lueberry leaves;antibac terial;extraction p rocess

TS201.3

A

1002－0306（2012）06－0309－05

2011－06－15 *通讯联系人

胡筱（1988－），女，硕士研究生，研究方向:食品安全。

2009年江苏省国际科技合作项目（BZ2009025）。