黄海东，李晓雁，杨红澎，卢显芝，韩 影

（天津农学院农学系，天津 300384）

龙胆内生菌的分离鉴定及其对苹果腐烂病菌的拮抗作用

黄海东，李晓雁，杨红澎，卢显芝，韩 影

（天津农学院农学系，天津 300384）

从云雾龙胆中分离到内生菌LD－b1，通过形态观察、生理生化实验和16S rDNA系统进化分析，鉴定其为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。该菌株的发酵上清液对苹果腐烂病菌的生长有显著的拮抗作用，拮抗活性物质对80℃以下的温度有一定耐受能力;在pH 5～10之间均有一定活性，对低pH更敏感;50μg/mL的蛋白酶K在37℃条件下处理1h可以使其抑菌活性完全丧失。抑菌曲线测定结果表明，摇瓶发酵48h时内生菌LD－b1的抑菌活性最高，在苹果果实上对腐烂病斑也具有明显的抑制作用。

龙胆，内生菌，苹果腐烂病菌，拮抗作用

苹果腐烂病俗称烂皮病，是一种对苹果危害严重的病害，而且越靠北部寒冷地区越严重，目前防治苹果腐烂病多采用化学试剂，虽然见效快、防治效果好，但长期使用化学杀菌剂不但会导致病菌对其产生抗药性［1－2］，而且苹果上残留的化学药剂也会对公众健康造成威胁并污染环境，为此，各国科学家都在积极探索能代替化学农药的防病新技术［3］。植物内生菌（endophyte）是指生活在植物活组织内而不引起任何直接和明显植物病变的一大类微生物，包括寄生或共生在植物体内的真菌和细菌。植物内生细菌是植物病害生物防治的天然资源菌，具有广阔的理论研究价值和开发应用前景［4－5］。云雾龙胆（Gentiana nubigena）是龙胆科龙胆属的植物，具有抗炎、利胆等作用［6］，本文对云雾龙胆内生菌进行了分离鉴定，研究了内生菌对苹果腐烂病菌的抑制效果，并对抑菌活性成分性质进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

云雾龙胆 由青海省藏医药研究院药物研究所提供;苹果腐烂病菌（Valsa mali Miyabe et Yamada）

由天津农学院园艺系田小卫博士提供;改良马丁培养基 蛋白胨5g，葡萄糖20g，酵母粉2g，K2HPO41g，MgSO40.5g，蒸馏水1000m L，pH 6.4±0.2;筛选培养基1 蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，云雾龙胆浸提液1m L，琼脂15g，蒸馏水1000m L，pH 7.0～7.5;筛选培养基2 马铃薯200g，葡萄糖20g，云雾龙胆浸提液1m L，琼脂15g，蒸馏水1000m L，pH 7.0～7.5;发酵培养基 蔗糖30g，蛋白胨2g，K2HPO40.3g，NaCl 0.1g，蒸馏水1000m L，pH 7.0～7.5;UNIQ－10试剂盒，pGEM－T Easy载体 Promega公司。

Biofuge型高速冷冻离心机 Heraeus公司; Tgradient型PCR仪 Biometra公司;DYY－6B型电泳仪和WD－9403F型紫外分析仪 北京六一仪器厂;LRH－150B型生化培养箱 广东医疗器械厂; HYG－III回旋式摇床 上海新蕊公司;HH－Z4型恒温水浴锅 郑州长城科工贸公司;752型紫外光栅分光光度计 上海精密科学仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 龙胆内生菌的分离 取一段云雾龙胆的茎，无菌水冲洗2次，用无菌滤纸吸干水分;在70%乙醇溶液中浸泡2m in，再用0.1%升汞浸泡30s，无菌水冲洗3次。在无菌条件下用刀片将外皮削去，并截成1cm左右的小段，置于筛选培养基表面，30℃培养4～8d。待平板有菌长出后，平板划线纯化，直至得到单菌落，斜面保存备用。

1.2.2 内生菌发酵液的制备 250m L三角瓶装100m L发酵培养基，接种后置于旋转式摇床上，180r/min、30℃培养48h，发酵液在6000 r/m in下离心10m in，取上清液用于抗菌活性测定。

1.2.3 抗菌活性测定 将苹果腐烂病菌活化和扩大培养，稀释制成106孢子/m L的悬液，取0.2m L孢子悬液与灭菌改良马丁培养基15m L混合制成平板，凝固后，用灭过菌的1cm直径打孔器在每个平板上打孔，除去孔内琼脂并向孔中加入0.1m L发酵上清液，以无菌蒸馏水和云雾龙胆浸提液［7］为对照，28℃培养4d后，测量抑菌圈直径。为了确保结果的准确性，每平板设3个重复。

1.2.4 龙胆内生菌的分类鉴定

1.2.4.1 形态特征 取固体平板上培养48h的菌株进行革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色，观察内生菌的形态特征。

1.2.4.2 生理生化特征 氧化酶、接触酶、H2S产生、吲哚、硝酸盐还原、脲酶等实验参考文献［8］进行。

1.2.4.3 16S rDNA序列测定及系统进化分析 将菌株LD－b1于30℃培养24h，离心后，用0.5mol/L NaCl洗1次，用1mg/m L溶菌酶溶液悬浮菌体，37℃作用30min，用UNIQ－10试剂盒提取细菌基因组DNA。以菌株LD－b1的基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物27F（5'－GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'）和1541R（5'－AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3'）扩增得到目的基因片段，经琼脂糖凝胶电泳纯化后与pGEM－T Easy载体连接，转化E.coli DH5a，用X－gal平板筛选含有插入DNA片段的白色转化子，经限制性内切酶酶切鉴定后送北京华大公司测序。将得到的16S rDNA序列与 GenBank中的核酸数据进行BLAST比对，搜索得到与其同源性最高的相关序列，采用软件Clustal X1.8对所获得的核苷酸序列进行分析，得到序列之间的相似值;用软件MEGA2.0计算出序列的系统进化距离，采用邻位相连法构建系统进化树［9］。

1.2.5 抑菌活性曲线的测定 将内生菌LD－b1种子液按照2%的接种量接入100m L液体培养基，30℃，180r/min振荡培养，每隔6h取样，测定OD600光吸收值，并取上清液进行抗苹果腐烂病菌的活性检测。

1.2.6 温度、pH、蛋白酶对抗菌物质活性的影响 内生菌发酵液在8000 r/m in条件下离心15m in后，上清液经0.22μm滤膜过滤后，分别作以下处理:a.分别经20、40、60、80、100℃处理1h和121℃处理30m in; b.将pH分别调至4.0～11.0;c.加入蛋白酶K，使其终浓度达到50μg/m L，37℃水浴0.5、1、2、4h。经上述处理后测定抗苹果腐烂病菌的活性，每处理重复3次。

1.2.7 在苹果果实上的抑菌实验 将红富士苹果用70%酒精消毒，晾干后，用接种针在苹果上刺一个6mm（深）×4mm（直径）的伤口，分别加入200μL的LD－b1发酵上清液和无菌水，2h后分别接种105孢子/m L的苹果腐烂病菌200μL，将果实放于果盘中，果盘用保鲜膜包裹，25℃放置，一周后观察结果。

2 结果与分析

2.1 龙胆内生菌的分离及抗菌效果测定

从云雾龙胆中分离得到多株内生细菌，制备内生菌发酵液，以无菌水为阴性对照，云雾龙胆提取液［7］为阳性对照，用混菌琼脂平板打孔法测定抑菌活性。结果筛选到一株龙胆内生细菌LD－b1，其发酵上清液能明显抑制平板上苹果腐烂病菌的生长（图1），而龙胆提取液也有一定的抑菌作用。

图1 菌株LD－b1对苹果腐烂病菌的抑制作用Fig.1 Antibiotic activity toward V.mali of strain LD－b1

2.2 菌株LD－b1的分类鉴定

2.2.1 形态特征 在固体平板上30℃培养1d，菌株LD－b1形成乳白色不透明菌落，菌落近似圆形，边缘不整齐，中间有小突起，直径0.6～1.1cm，不分泌色素;LD－b1菌体细胞为短杆状，大小0.5～0.6μm× 1.5～2.1μm，革兰氏阳性，有芽孢。

2.2.2 生理生化特性 菌株LD－b1好氧生长，生长的温度范围为8～50℃，pH范围5.5～8.5，NaCl浓度范围0～7%;能够利用的碳源有:葡萄糖、蔗糖、乳糖、树胶醛糖、木糖、半乳糖、甘露醇、N－乙酰－葡糖胺、葡糖酸盐;不能利用淀粉、糊精、蜜二糖、鼠李糖和山梨醇。其他生理生化指标的实验结果如表1所示。

2.2.3 16S rDNA序列测定及系统进化分析 PCR扩增得到菌株LD－b1的16S rDNA片段，经DNA测序长度为1444bp，在GenBank/EMBL/DDBJ中的序列登记号为JF932295。将16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行 BLAST比对，结果表明菌株LD－b1与芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的同源性较高，且与 Bacillus pum ilus KNUC389和 Bacillus pum ilus KNUC235的同源性最高，分别为达到 99.8%和99.7%。将其与芽孢杆菌属9个相近的种进行遗传距离计算，用邻位相连法构建系统进化树（图2），可以看出，菌株 LD－b1与短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）划分在同一簇内，结合形态学和生理生化特征指标，确定云雾龙胆内生菌LD－b1为短小芽孢杆菌。

表1 菌株LD－b1的生理生化特征Table 1 Physio－biochemical characteristics of strain LD－b1

图2 菌株LD－b1的16S rDNA序列系统进化树Fig.2 Phylognetic tree of LD－b1 16S rDNA sequences

2.3 内生菌LD－b1对苹果腐烂病菌的抑菌曲线

由图3中内生菌LD－b1的细胞生长曲线可以看出，培养48h的OD600最大，之后进入衰亡期;而抑菌圈直径也随着内生菌的生长而变大，在36～48h之间LD－b1的抑菌活性最大，说明后期研究中，应该将摇瓶发酵周期控制在此时间段内。

图3 菌株LD－b1对苹果腐烂病菌的抑菌活性曲线Fig.3 Antibiotic activity curve toward V.mali of strain LD－b1

2.4 温度、pH、蛋白酶K对抗菌物质活性的影响

内生菌LD－b1的无菌滤液经不同温度处理后进行抑菌活性检测，由图4可以看出，抗菌物质对热有一定的耐受能力，20℃的抑菌活性与对照（发酵液不经热处理）相同，40℃处理1h后样品抑菌活性为对照样品的91%，100℃以上的处理后样品无抑菌活性。

由图5可知，菌株LD－b1产生的抗菌物质对低pH更敏感，对偏碱环境有一定的耐受能力。在pH为8时抗菌活性降低22.5%，pH为9时抗菌活性降低48.7%，在pH小于4或大于11的条件下，抗菌活性完全丧失。

图4 温度对胞外抗菌物质活性的影响Fig.4 Effect of temperature on the antibiotic activity of extracellularmetabolite

图5 pH对胞外抗菌物质活性的影响Fig.5 Effect of pH on the antibiotic activity of extracellularmetabolite

在样品中加入蛋白酶K，30℃处理30m in后，抑菌圈直径减少为对照的38.9%，处理时间大于1h，则抑菌活性完全消失，结合其对温度和pH的稳定性实验结果，判断内生菌LD－b1产生的抗菌成分为蛋白类物质。

2.5 内生菌LD－b1在苹果果实上的抑菌效果

从图6可以看出，内生菌LD－b1产生的抑菌物质能够显著地抑制苹果腐烂病菌对果实的侵蚀。接种病菌后室温放置 6d，对照果实的病斑直径为17.5mm，LD－b1样品处理后果实的病斑直径为2.4mm，仅为对照的13.7%。

图6 不同处理苹果的病斑Fig.6 Decay lesion of apples after different inoculation

3 结论

中药内生菌能产生具有抗菌等多种活性的代谢产物，是植物病害生物防治的重要微生物资源。目前，对苹果腐烂病的生防研究主要使用放线菌中的链霉菌属和内生真菌，内生细菌对该种病害拮抗作用的报道相对较少［10－11］。芽孢杆菌属是常见的内生细菌种类，可以产生杆菌肽、环脂、氨基酸类、核酸类、类噬菌体颗粒等多种抗菌物质，能抑制多种植物及人类病原菌［12］;而且芽孢杆菌具有生长快、营养简单、抗逆性强等优点，非常适合开发成防菌剂。本研究从云雾龙胆中分离筛选到一株对苹果腐烂病菌有显著拮抗作用的内生菌:短小芽孢杆菌LD－b1。该菌株产生的抗菌成分为蛋白类物质，摇瓶发酵48h的抗菌活性最强，在苹果果实上对腐烂病斑也具有明显的抑制作用，说明其在苹果腐烂病菌防治方面有很好的应用前景。该菌株产生抗菌物质的发酵条件优化、环境安全评估等仍有待进一步的深入研究。

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Identification of endophyte from Gentiana nubigena and antagonism on the Valsa mali

HUANG Hai－dong，LIXiao－yan，YANG Hong－peng，LU Xian－zhi，HAN Ying

（Department of Agronomy，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China）

Endophytic strain LD－b1 was isolated from Gentiana nubigena.Accord ing to the characteristics of morphology，physiology and biochem istry tests and the com parison of 16S rDNA sequence，strain LD－b1 was identified as Bacillus pum ilus.The fermentation broth of LD－b1 showed antagonism activities against Valsamali.The antibiotic active substance was stab le to the tem perature lower than 80℃，and the pH range from 5 to 10，butmore suscep tib le to lower pH.The antifung la activity lost under the treatmentw ith 50μg/m L p roteinase K in the cond itions of 37℃ longer than 1h.The results of shaking flask fermentation curves showed antibiotic ac tivities reached the maximum at48h.The lesion d iameter was smaller obviously when app le fruits were treated w ith LD－b1.

Gentiana;endophyte;Valsa m ali;antagonism

TS201.3

A

1002－0306（2012）06－0215－04

2011－06－01

黄海东（1972－），男，副教授，主要从事资源细菌及工程方面的研究。

天津市高等学校科技发展基金（20100604）;天津市科委基础重点项目（11JCZDJC16600）。