贺永明 （辽宁农业职业技术学院 熊岳 115009）



一株枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化

贺永明 （辽宁农业职业技术学院 熊岳 115009）

采用正交试验对1株枯草芽孢杆菌的发酵培养基进行优化。确定了最佳的培养基配方为：葡萄糖25g/L，豆粕粉60g/L，玉米浆8g/L，在接种量为2%的情况下，发酵温度37℃，发酵时间24h，所获得活菌数约为5.3×109CFU/mL。

枯草芽孢杆菌 发酵培养基 优化

微生态制剂成为抗生素较为理想的替代品[1]。芽孢杆菌作为微生态制剂使用的微生物，是国际公认可在饲料中直接使用的微生物菌种[2]。由于其具有耐酸、耐高温和耐高压，是一类好氧微生物，通过生物夺氧，降低氧化还原电势，有利于厌氧微生物的生长，从而保持肠道微生态系统平衡，而且，芽孢杆菌在肠道中能产生多种消化酶和有机酸，提高饲料的利用率，抑制有害菌的繁殖、保证宿主健康[2-4]。因而其研究和应用受到广泛重视。

芽孢杆菌的发酵培养是工业化大规模生产芽孢杆菌制剂的前提。发酵培养基配方是影响微生物发酵的重要因素之一[4-6]。本文以一株枯草芽孢杆菌为研究对象，通过对其摇瓶发酵培养基进行优化，其结果为芽孢杆菌制剂的工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，购买于中国科学院微生物研究所，菌种编号8306。

1.1.2 仪器 恒温振荡器摇床、pH-211酸度计、高压蒸汽灭菌锅、高速万能粉碎机、无菌超净台、电子天平。

表1 正交试验因素水平

1.1.3 培养基 种子培养基：牛肉膏3g，大豆蛋白胨10g，NaCl 5g，定容至1000ml，pH7.0，0.1MPa灭菌20min。发酵培养基：本试验以葡萄糖、豆饼粉、玉米浆作为碳源和氮源，选用3因素3水平按正交设计表L9(33)安排试验(表1)。500ml摇瓶装液量100ml，pH值7.0，0.1MPa灭菌20min。每种培养基3个重复，共27个培养基。试验结果为3次重复试验的平均值。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化 将枯草芽孢杆菌从保存的斜面转接于新鲜试管斜面，于37℃培养24h。

1.2.2 种子液的制备 取培养好的斜面菌种再接种于盛有100ml无菌种子培养基的250ml三角瓶中，置摇床37℃振荡培养18h，转速为160r/min。

1.2.3 药瓶培养 分别取2mL种子液，接入盛有100mL无菌液体培养基的500mL三角瓶中(接种量为2%V/V)。置摇床中，37℃震荡培养24h，转速为160r/min，培养结束后测定活菌数(CFU/ml)。每个培养基做3个重复。

1.2.4 活菌计数的测定 采用倾注倒平板法：采用无菌水作一系列稀释，每一稀释度作3个平皿，37℃培养24h，进行菌落计数。

1.2.5 数据处理 采用SPSS10.0对正交试验结果进行方差分析[7]。

2 结果与分析

由表3的方差结果可知，3因素对枯草芽孢杆菌发酵影响的显著性依次为：葡萄糖>玉米浆>豆饼粉，即葡萄糖对菌体的增殖的影响显著(P<0.05)，玉米浆次之，豆饼粉影响最小(P>0.05)。

表2 发酵培养基优化正交试验结果

表3 正交试验方差分析

注：F0.1(2,2)=9.0

以培养基结束时的活菌数(CFU/mL)作为考察指标，从表2可知，试验条件下优化水平的最佳的组合是A3B2C3，即葡萄糖浓度是25g/L，豆饼粉浓度为60g/L，玉米浆浓度是8g/L。在接种量为2%的情况下，当采用此种配比的发酵培养基37℃培养24h后，活菌数目可达5.3×109CFU/ml。

3 讨论

本试验研究了营养条件对枯草芽孢杆菌菌数的影响。在不同营养条件的研究中，证明了该菌株的生长较适应速效碳源葡萄糖，但长效氮源豆饼粉对该菌株的生长影响较少。秦艳等[4]在枯草芽孢杆菌发酵条件的优化研究中，证明葡萄糖和酵母浸出物对菌数的提高作用显著。刘辉等[8]在一株枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化中发现，豆粕液是影响芽孢杆菌菌数生长的较为显著的因素。本试验出现不同的结论可能芽孢杆菌能很好地利用酵母浸出物，与酵母浸出物富含氨基酸、维生素和未知生长因子有关；另外，不同的菌株，不同的营养配方，在一定范围内也会影响菌数的生长。玉米浆中富含氨基酸、生物素、维生素和微量元素等，是微生物生长或代谢产物合成的促进剂，也会影响到芽孢杆菌菌数的生长，这与谷春涛等[6]的研究一致。

微生态制剂的推广及其使用效果，一定程度上因成本过高和产品的质量而受到影响。因此，在微生态菌株的发酵培养中，降低培养基的成产成本，提高单位体积培养液中的菌体数目至关重要。本文仅对枯草芽孢杆菌发酵培养的条件进行了初步研究，该结果对枯草芽孢杆菌在发酵罐的生产工艺上提供了重要的参考数据，对后续的工业发酵有重要意义。

[1] 朱馨蕾. 动物微生态制剂的研究进展及存在问题[J]. 山东畜牧兽医. 2008,8: 9-11.

[2] 熊峰, 王晓霞, 余雄. 芽孢杆菌作为微生物饲料添加剂的生理功能研究进展[J]. 北京农学院学报, 2007,22(1): 76-79.

[3] 张保全, 朱年华. 芽孢杆菌在畜牧业中应用的研究进展[J]. 江西畜牧兽医杂志, 2007,1: 2-3.

[4] 秦艳, 李卫芬, 黄秦. 枯草芽孢杆菌发酵条件的优化[J]. 饲料研究, 2007, 12: 70-74.

[5] 李超, 孙冬岩. 枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化[J]. 饲料研究, 2009, 10: 55-56.

[6] 谷春涛, 彭爱铭, 萨仁娜等. 地衣芽胞杆菌TS-01发酵培养基的优化[J]. 饲料工业, 2003,24(8): 19-20.

[7] 周德庆. 微生物学试验教程[M]. 北京: 高等教育出版社, 2006.

[8] 刘辉, 魏祥法, 井庆川等. 一株枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化[J]. 山东农业科学, 2007,1: 100-101.

（2012–03–03）

S852.61+6

A

1007-1733(2012)05-0014-02