阮洪生，苗晶囡，马丁，刘树民

（1．黑龙江中医药大学中医药研究院，哈尔滨150040；2．黑龙江八一农垦大学生命学院）

秦艽为龙胆科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall的干燥根，具有祛风湿，清湿热，止痹痛，退虚热的功效，临床用于风湿痹痛、中风半身不遂，筋脉拘挛，骨节酸痛，湿热黄疸，骨蒸潮热，小儿疳积发热[1]的治疗。秦艽中主要成分是龙胆苦苷，其中龙胆苦苷含量最高可达18%[2]。该类成分具有保肝、益肝、抗炎镇痛等活性[3-5]。牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl．的干燥根，具有逐瘀通经，补肝肾，强筋骨，利尿通淋，引血下行的功效，临床用于经闭，痛经，腰膝酸痛，筋骨无力，眩晕[1]等的治疗。蜕皮甾酮为牛膝中主要活性成分，其作用与牛膝“补肝肾，强筋骨”的功效相吻合[6]。秦艽善祛风湿通络止痛，为祛风湿之要药，风药中之润剂，三痹必用之品，风湿痹痛无问新久、或偏寒偏热，均可配伍应用。牛膝既能补肝肾，强筋骨，又能通血脉而利关节，性善下行，治下半身腰膝关节酸痛为其专长。因此，在独活寄生汤、身痛逐瘀汤、三痹汤、羌活汤等一系列治疗痹证的常用方剂中，秦艽和牛膝是很重要的方药组成。秦艽中龙胆苦苷和牛膝中蜕皮甾酮含量检测方法文献报道很多[7-10]，但对两者同时检测还未见报道。采用RP-HPLC法同时测定了秦艽中龙胆苦苷和牛膝中蜕皮甾酮含量，为治疗痹症药物研究提供了可行的检测标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪，FA2004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司），RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），CW-2000型超声-微波协同萃取仪（上海新拓微波溶样测试技术有限公司）。

1.2 试药

对照品：龙胆苦苷（成都曼思特生物科技有限公司，批号：A0170，供含量测定用），蜕皮甾酮（中国药品生物制品检定所，批号：111638-200603，供含量测定用）。秦艽、牛膝饮片购于哈药集团世一堂饮片厂，经检验，均符合《中国药典》2010年版一部规定。甲醇、乙腈为色谱纯（DIMA，USA），其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品储备液

精密称取对照品龙胆苦苷5.0 mg、蜕皮甾酮2.5 mg，分别置25mL量瓶中，加甲醇适量溶解并定容，制得各对照品储备液。依次精密吸取上述2个储备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于同一25 mL量瓶中，以甲醇定容，即得。

2.1.2 供试品溶液

将秦艽和牛膝干燥、粉碎、过40目筛后，准确称取秦艽和牛膝样品2.0 g（比例为1∶3），置于250 mL干燥萃取瓶中，加60%的乙醇50 mL，在超声波工作的状态下，选取微波功率80W，提取时间10 min的条件下进行超声-微波协同萃取，提取液减压回收，残渣干燥后加甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液，4℃冰箱避光、密封保存[11]。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

2.2.1 色谱条件[12]

色谱柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%醋酸水溶液（B）进行梯度洗脱，0～10 min，流动相A∶B（30∶70）；10～13 min，流动相A∶B（68∶32）；13～25 min，流动相A∶B（30∶70）。流速：1.0 mL·min-1；检测波长：254 nm；柱温：25℃；进样量10μL。理论塔板数按龙胆苦苷计不低于2 000，按β-蜕皮甾酮计不低于3 000。

2.2.2 系统适用性试验

按“2.2.1”项下的色谱条件，精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各1 010μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果对照品、供试品溶液色谱图中龙胆苦苷、蜕皮甾酮均达到基线分离。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图A.龙胆苦苷对照品；B.蜕皮甾酮对照品；C.样品Fig.1 HPLCChromatrograms of reference substances（A、B）and sample（C）

2.3 线性关系考察

精密吸取混合对照品储备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置10 mL量瓶中，甲醇定容，制成系列对照品溶液。按“2.2.1”项下的色谱条件测定峰面积，以溶液浓度X（μg·mL-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，龙胆苦苷和蜕皮甾酮的线性回归方程分别为:

结果表明，龙胆苦苷和蜕皮甾酮进样浓度分别在0.80～20.00，0.40～10.00μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.4 精密度实验

精密吸取同一混合对照品溶液，连续进样5次，每次进样10μL。记算龙胆苦苷和蜕皮甾酮峰面积积分值，RSD分别为0.43%和0.91%，结果表明精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，按上述色谱条件分别于0，2，4，8，12，24 h测定峰面积，龙胆苦苷和蜕皮甾酮的RSD分别为1.21%、1.43%（n=6）。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

精密称取同一批样品6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，结果龙胆苦苷和蜕皮甾酮平均含量分别为58.74 mg·g-1和1.56mg·g-1，RSD分别为1.32%和0.97%。结果表明方法的重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品6份，每份约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入一定浓度的混合对照品溶液适量，按照“2.1.2”项下方法制备供试溶液，按上述色谱条件测定，计算回收率。龙胆苦苷和蜕皮甾酮的平均回收率（n=6）分别为100.02%和99.95%，RSD分别为0.87%和1.02%。

2.8 样品含量测定

按“2.1.2”项下方法，取6批供试品，每批样品平行制备3份供试品溶液，按上述色谱条件测定，记录色谱图。采用外标法分别计算龙胆苦苷和蜕皮甾酮的含量。结果见表1。

表1 样品含量测定结果（n=6）Table1 Test results of samples

3 讨论

3.1 提取方法的选择

考察了回流提取法、索氏提取法、超声提取法及超声-微波协同萃取法4种不同提取方法，结果超声-微波协同萃取法提取率高，且操作简便省时。在水，甲醇、40%乙醇、60%乙醇、95%乙醇作为溶剂的比较试验中，结果60%乙醇的提取率高，而且对被测两组份的干扰较小。

3.2 流动相的选择

分别考察了甲醇-水、甲醇-0.1%醋酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%醋酸水溶液等不同的流动相系统。结果以乙腈-0.1%醋酸水溶液系统，基线平稳，峰形及分离好。在实验中，采用等度洗脱保留时间较长且分离度较差，选择梯度洗脱龙胆苦苷和蜕皮甾酮可以有效分离，色谱峰没有干扰。

3.3 检测波长的选择

药典中关于秦艽含量测定龙胆苦苷选择的波长是254 nm，牛膝含量测定中蜕皮甾酮选择的波长是250 nm。经PAD全波长扫描后，查看三维图谱，确定待测的龙胆苦苷和蜕皮甾酮在254 nm处有最大吸收，且其色谱峰表观丰度高，基线平稳，因此选择254 nm作为检测波长。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典：一部[M]．北京:中国医药科技出版社，2010.

[2]宋振玉，籍秀娟，刘耕陶.秦艽生物碱甲的药理作用Ⅰ：对大鼠甲醛性“关节炎”及肾上腺皮质功能的影响[J].生理学报，1958，22:201-205.

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[4]徐丽华，徐强.龙胆对实验性肝损伤的影响[J].中药药理与临床，1994，10（3）:20-22.

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[8]冯英菊，杨甫昭.RP-HPLC法测定大鼠血清中龙胆苦苷的含量[J].西北药学杂志，2002（2）:51-53.

[9]张翠英，梁生旺，张广强.不同产地牛膝中蜕皮甾酮的含量测定[J].中国药学杂志，2001，36（10）:699-700.

[10]陈幸，黎万寿，朱久武，等．RP-HPLC法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量[J].药物分析杂志，2000，20（4）:234-236.

[11]齐海峰，陈维静.星点设计-响应面法优选大黄中大黄酸的提取工艺[J].黑龙江八一农垦大学，2012，24（5）:46-49.

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