孙思 杜小文 徐剑炜a

（1.复旦大学附属中山医院急诊科，a整形外科，上海 200032；2.浙江省金华市人民医院泌尿外科，浙江 金华 321001）

骨髓基质中的多能细胞能够分化成为多种中胚层来源的间质细胞，故被称为骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）。这些细胞在一定条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌样细胞，而且经过20～30个培养周期，仍能保持多向分化的潜能[1－2]。

本试验采用密度梯度离心和贴壁分离相结合的方法分离培养大鼠BMSCs，用形态学观察和流式细胞仪鉴定其表面抗原特性；用5－氮杂胞苷（5-azacy tidine，Sigma）在体外作用于大鼠BMSCs，诱导其向肌样细胞分化，最后通过免疫组化染色来鉴定这些细胞的蛋白表达；旨在探讨体外诱导BMSCs向横纹肌肌细胞分化的可行性，为干细胞在组织工程学的应用提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 标本采集 选用1周龄SD大鼠，处死后置于75%乙醇中浸泡10 min。无菌条件下分离大鼠的四肢长骨，用1 mL注射器抽吸培养液（Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium，DEME，Sigma），从骨髓腔内冲出骨髓，将骨髓液注入Percoll细胞分离液试管中，890 g／min离心，取中间的单个核细胞悬浮层，再加入培养液2 mL制成单细胞悬液，再离心后弃去上清液，加入2 mL培养液吹打制成细胞悬液。台盼蓝细胞计数后将单细胞悬液以1×105／mL的密度接种于直径10 cm的无菌培养皿内（培养基含10%优质胎牛血清），置于5%CO2、37℃条件下培养。

1.2 细胞培养 接种后第2天更换培养基，去掉非贴壁细胞，以后每3 d换液1次。待5～10 d细胞生长融合达90%时，用0.25%的胰蛋白酶加2 g／L乙二胺四乙酸（EDTA）3 mL，消化细胞。然后将细胞以1∶3接种于直径10 cm培养皿培养，加入10 mL培养液，于37℃恒温、5%CO2环境中培养。……