熊东升，吕颜枝，2，代盈盈，王文丽，赵慧英＊

（1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100；2.徐州生物工程职业技术学院，江苏徐州221006）

雌激素是下丘脑－垂体－性腺轴中影响动物生殖活动的重要激素之一，其主要通过雌激素受体（estrogen receptor，ER）调节靶细胞，ER 包括 ERα和ERβ两种经典亚型。腺垂体通过分泌多种激素如催乳素（prolactin，PRL）和促性腺激素（包括促卵泡素（follicle－stimulating hormone，FSH）和黄体生成素（luteinizing hormone，LH）等调节机体生殖相关内分泌活动，雌激素对这些激素的分泌具有反馈调节作用。有研究表明［1－2］，妊娠大鼠腺垂体中有大量ER阳性细胞，其表达量随着妊娠进行而增加；RTPCR定量分析发现，在妊娠中期ERαm RNA表达有一个显著的高峰，但ERα蛋白水平表达恒定，ERβ在妊娠期的表达没有发生变化，与雌激素的水平不相关。雌激素可通过ER的介导来调节下丘脑促性腺激素释放激素（Gn RH）的刺激作用，进而调节FSH和LH的分泌；另外，雌激素还促进PRL的合成、储存和释放，为产后泌乳做好准备［3－4］。朱雨岚等［5］用双标记的方法对人类多激素型垂体腺瘤的研究中证明了ER在垂体的PRL、FSH和LH分泌细胞中表达。但目前对于妊娠期山羊腺垂体中ERα和ERβ与激素分泌细胞的共存研究尚未见报道。本试验用免疫组化双标记法对腺垂体中ERα和ERβ与PRL、FSH和LH的共表达进行研究，为阐明妊娠期山羊的生殖内分泌调节提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 妊娠前期（1 d～30 d）、中期（31 d～120 d）、后期（121 d～150 d）山羊各5只，购自杨凌农户。

1.1.2 主要试剂和仪器 抗兔免疫组织化学Max－Vision超敏试剂盒、兔抗羊PRL多克隆抗体、棕色DAB染色试剂盒，购自福州迈新生物技术开发有限公司；兔抗羊（ERα、ERβ、FSH、LH）多克隆抗体，购自北京博奥森生物技术开发有限公司；蓝色DAB显色剂、葡萄糖过氧化物酶，购自美国SIGMA公司；德国Leica石蜡切片机；Motic显微照相机；江苏捷达科技形态学分析软件。

1.2 方法

1.2.1 取材及材料处理 山羊经放血致死后迅速取下羊头，先用37℃的生理盐水向两侧颈总动脉同时注入400 mL～500 mL冲去残血，随后灌注等量4℃的40 g／L多聚甲醛固定液。开颅取出垂体后固定24 h。固定后自来水冲洗24 h，再酒精脱水，二甲苯透明后浸蜡包埋，最后做石蜡连续切片（6μm）。

1.2.2 免疫组织化双标记法染色法程序 切片经脱蜡复水和抗原修复后做双标染色：①滴加30 mL／L过氧化氢，室温10 min；②滴加ERα和ERβ多克隆抗体之一（1∶200）室温下孵育60 min；③滴加Max Vision试剂室温下孵育10 min～15 min；棕色DAB呈色；④25 g／L高锰酸钾－50 mL／L硫酸洗脱液洗脱5 min，灭活ER剩余抗体活性，再用5 g／L焦亚硫酸钠还原30 s。⑤滴加第二种一抗PRL、FSH 和LH 之一（1∶200）室温下孵育60 min；⑥滴加Max Vision试剂室温下孵育10 min～15 min；蓝色DAB呈色，以上各步之间均用0.01 mol／L PBS缓冲液冲洗。最后常规脱水、透明、封片。阴性对照试验用0.01 mol／L PBS代替两种一抗，其他步骤相同。最后观察结果，显微照相及用江苏捷达科技形态学分析软件分析。

2 结果

2.1 免疫组化双标染色的结果

经免疫组织化学双标记法染色的切片，ERα或ERβ免疫阳性产物为棕褐色；PRL、FSH和LH免疫阳性产物为蓝色；双标记则为棕黑色。

2.1.1 妊娠各期ERα与3种激素的共存 在妊娠前期ERα与PRL共同着色的细胞数量较少，多呈椭圆形，ERα多存在于PRL细胞的胞质中，胞核中少见着双色，背景呈浅蓝色（图1A1）；妊娠中后期着蓝色较深的PRL阳性细胞较多，着棕色的ERα阳性细胞散在于PRL阳性细胞之间，仅少量的双着色细胞膜（图1A2、图1A3）。妊娠前期ERα与FSH共同着色的细胞数量较多，多数存在于血窦周围呈椭圆形或多边形，胞质重合着色较深，其他区域细胞可见胞膜着双色，背景呈浅棕色，妊娠前期和中期ERα和FSH共存于腺垂体细胞的胞质和胞膜中（图1B1、图1B2）；后期多在胞质中共存（图1B3）；妊娠前期和中期ERα与LH共同着色位置在细胞的胞质中（图1 C1、图1C2）；妊娠后期可见胞膜着双色，还可见着棕色的ERα颗粒（图1C3）。

图1 山羊妊娠各期ERα和与PRL、FSH和LH在垂体中的免疫组化双标染色（400×）Fig.1 The immunohistochemical double labeled stain of ERαwith PRL，FSH，LH in pituitary of different gestation periods in goats（400×）

2.1.2 妊娠各期ERβ与3种激素的共存 ERβ和PRL的共存的细胞个体较小呈胞质深着色，夹杂在浅蓝色的PRL阳性细胞之间，数量在整个妊娠过程中有逐渐增多的现象，ERβ多数存在于PRL细胞的胞质中，少数存在于胞核中（图2A1、A2、A3）。妊娠过程中ERβ与FSH的共同着色细胞多为腺垂体远侧部的嗜碱粒细胞，形状与ERα和FSH共存的细胞相似，阳性物质多存在于胞质和胞核，未见有胞膜着色的，数量也呈减少趋势（图2B1、B2、B3）。在妊娠后期有个别全细胞着色（图2 B3）。妊娠前期和中期ERβ与LH的共同着色细胞为腺垂体远侧部的嗜碱粒细胞，阳性物质呈多边形（图2C1、C2），数量随妊娠的进行逐渐增多。在妊娠后期阳性细胞在胞质和核膜均有ERβ和LH的共存，未见核着色（图2C3）。

图2 山羊妊娠各期ERβ与PRL、FSH和LH在垂体中的免疫组化双标染色（400×）Fig.2 The immunohistochemical double labeled stain of ERβwith PRL，FSH，LH in pituitary of different gestation periods in goats（400×）

2.2 妊娠各期ER与腺垂体中3种激素共存细胞的数量

免疫组化双标染色结果显示，ERα和ERβ分别与PRL、FSH和LH共存的阳性细胞数量有一定变化趋势，表现为ERα和ERβ分别与PRL和LH共存的阳性细胞的数量随妊娠进行逐渐增加；与FSH共存的阳性细胞数量则逐渐减少（表1）。

表1 妊娠期腺垂体中阳性细胞的数量Table1 The number of positive cells in adenohypophysis during pregnancy

3 讨 论

Gonza M等［6］研究大鼠垂体中ER两种亚型的分布，发现在大鼠整个发情期，ERα阳性产物均多数分布于PRL细胞，少数分布于FSH细胞，ERβ阳性产物仅有少数分布于PRL和FSH细胞；ERα的阳性产物存在于胞质及胞核，且与发情周期有关，ERβ的阳性产物多存在于胞质。本试验免疫组织化学染色显示，妊娠期山羊腺垂体ERα和ERβ均与PRL、FSH和LH有共存，主要共存于胞质中，也有少数在胞膜或胞核中共存，并随着妊娠的进行在细胞中分布位置发生变化。说明不同的动物不同的生理时期ERα和ERβ在细胞中的分布位置和存在细胞的类型也不一样。对绵羊垂体中ER的研究表明［7］，妊娠145 d后绵羊垂体中ERα蛋白的表达较之前有很大的升高，但ERβ蛋白的表达与妊娠后80 d和120 d相比则是减少。研究表明［8］，ER在分泌PRL和PRL细胞增生方面起重要作用，ER基因敲除小鼠PRL mRNA表达明显减少，PRL细胞数减少，而LH和FSH 细胞表达增加［9］。本试验结果表明ER与PRL和LH共存阳性细胞的数量表现为随妊娠的进行逐渐增加，与FSH的共存则相反，与该研究结构一致。胞浆内的ER具有运载雌激素的作用，胞核内的ER具有转录因子的作用［10－11］，两种ER亚型均可以介导雌激素的作用［12－13］，表明在妊娠期雌激素可能通过ERα和ERβ来作用于PRL、FSH和LH的分泌，但是以ERα对PRL和FSH的分泌调控为主，推测其主要目的是为产后泌乳做准备。

［1］杨永倩.ER和ICAM－1在妊娠早期和流产大鼠下丘脑、垂体、卵巢和子宫中的表达［D］.陕西杨凌：西北农林科技大学，2008.

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