舒凡帆，董 辉，赵其平，李 婷，朱顺海，韩红玉，姜连连，孔春林，王 晔，薛 璞，邹丰才，黄 兵＊

（1.云南农业大学动物科技学院，云南昆明650201；2.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点实验室，上海200241）

鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria）球虫引起的一种原虫病，能引起鸡生长发育停滞，饲料报酬降低，甚至死亡，对全球养鸡业每年造成大约20亿英镑损失［1］。长期以来，抗球虫药是预防和控制球虫病的主要方法，但药物无节制的使用导致球虫抗药性的大量产生。另一方面，政府和消费者希望药物添加剂能逐步被淘汰。幸运的是，用球虫活疫苗来代替药物已经被证明是可行的方法，目前欧盟约80%的鸡群是通过使用商品化球虫活疫苗来免疫预防球虫病［2］。

堆型艾美耳球虫（E.acervulina）对鸡致病力中等，主要寄生于鸡十二指肠，分布广、感染率高，对养鸡业的危害仅次于柔嫩艾美耳球虫［3］。在中国，堆型艾美耳球虫是肉鸡养殖中最常见的3种球虫之一，也是球虫活疫苗常包含的虫种之一［4］。

通过前期研究，已获得一株堆型艾美耳球虫早熟株。该早熟株致病力比母株弱，免疫原性与母株相当，遗传稳定性好，对7种常见抗球虫药物敏感［5－6］。本文拟研究该早熟株不同免疫剂量的保护效果，为确定推荐免疫剂量和制备球虫活疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 二黄鸡，购自上海市郊某孵化场。饲养于严格控制的无球虫的隔离笼舍中，饲喂不添加任何抗球虫药的全价饲料。试验前连续2 d检查粪便，确认无球虫感染。

1.1.2 虫株 堆型艾美耳球虫母株（资源号CAAS 2111101），由黄兵等用单卵囊分离技术分离于上海郊区某大型鸡厂，潜在期99 h。堆型艾美耳球虫早熟株（资源号CAAS 2111105），由中国农业科学院上海兽医研究所诱导获得，潜在期84 h［5］。2个虫株孢子化卵囊置于25 g／L的重铬酸钾溶液中4℃保存，试验前经鸡体传代获得新鲜卵囊后保存备用。

1.2 方法

1.2.1 第一批试验 将480只6日龄雏鸡逐只称重，按每组30只鸡随机分为16组，调整各组体重基本相同。7日龄进行首免，其中第1组～第7组用早熟株免疫，免疫剂量分别为每只鸡100、200、400、600、800、1 000及2 000个孢子化卵囊；第8组～第14组用母株免疫，免疫剂量与早熟株相同。第15组为阳性对照组（不免疫攻虫组），第16组为空白对照组（不免疫不攻虫组）。14日龄进行二免，各组免疫剂量与首免相同。二免后7 d称重，计算6日龄～21日龄期间（免疫期间）各组的增重。除第16组外，各组分别用母株进行攻虫，剂量为每只鸡15×104个孢子化卵囊。攻虫后4 d～7 d，每天收集粪便称重，用麦氏虫卵计数法计每克粪便卵囊数（OPG），统计各组平均每只鸡的卵囊排出总量，计算卵囊减少率。28日龄结束试验，逐只称重、处死，取十二指肠进行肠道病变记分，并计算21日龄～28日龄期间（攻虫期间）的增重。试验期间观察记录各组鸡的精神、食欲、饮水、发病、死亡及粪便状况。

1.2.2 第二批试验 根据第一批试验结果，对获得的两个免疫效果较好的剂量进行重复试验。取120只鸡称重，按每组30只鸡随机分为4组，调整各组体重基本相同。第1组和第2组为第一批试验免疫效果较好的两个免疫组，第3组为不免疫攻虫组，第4组为不免疫不攻虫组。7日龄首免，14日龄二免，21日龄称重后，除了第4组外，其余各组每只鸡接种母株20×104个孢子化卵囊。攻虫后处理措施、试验周期等与第一批试验相同。

1.2.3 观测指标 用3项指标综合判断：①病变记分，依据肠道病变程度分别记为0～4分。②相对增重率，以攻虫后7 d间各组的增重占不免疫不攻虫组增重的百分率，即相对增重率＝（各组平均增重÷不免疫不攻虫组平均增重）×100。③卵囊减少率，以各组平均每只鸡在攻虫后4 d～7 d排出卵囊量计算卵囊减少率，卵囊减少率＝（不免疫攻虫组排出卵囊总量－免疫攻虫组排出卵囊总量）÷不免疫攻虫组排出卵囊总量×100。

1.2.4 数据处理 采用SPSS 11.5统计软件对各组的相对增重及病变记分进行方差分析，其中，P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 第一批试验

堆型艾美耳球虫早熟株试验结果见表1。由表1可知，在增重方面，各免疫组在免疫期间的增重和不免疫组相当（P＞0.05）；攻虫期间免疫剂量为400个／羽～2 000个／羽的增重均与健康对照组相当（P＞0.05），其中600、800个／羽的增重更接近健康对照，而免疫剂量为100个／羽～200个／羽的增重明显低于健康对照组（P＜0.05）。在肠道病变记分方面，各免疫组病变记分相当，均轻于感染对照组，但差异不显著。在卵囊减少率方面，免疫剂量400个／羽～2 000个／羽的卵囊减少率超过90%，而免疫剂量100个／羽和200个／羽的卵囊减少率相对偏低。综合免疫剂量、免疫期间与攻虫期间的增重、卵囊减少率等指标分析，拟将600、800个卵囊／羽作为堆型艾美耳球虫早熟株的推荐免疫剂量，进行第二批试验。

表1 堆型艾美耳球虫早熟株不同免疫剂量的保护效力Table1 The effectiveness of different immunizing dosages with precocious line of E.acervulina

堆型艾美耳球虫母株试验结果见表2。由表2可知，在增重方面，各免疫组在免疫期间的增重和健康组相当（P＞0.05）；攻虫后，免疫剂量为600个／羽～1 000个／羽的增重与健康对照组相当（P＞0.05），均明显高于不免疫感染对照组（P＜0.05），而免疫剂量为100个／羽～400个／羽和2 000个／羽的增重均与不免疫感染组相当。在肠道病变记分方面，各免疫组病变记分相当，均轻于感染对照组，但差异不显著。在卵囊减少率方面，免疫剂量400个／羽～2 000个／羽卵囊减少率高达90%以上，免疫剂量100个／羽和200个／羽在卵囊减少数量方面较差。

表2 堆型艾美耳球虫母株不同免疫剂量的保护效力Table2 The effectiveness of different immunizing dosages with parent strain of E.acervulina

2.2 第二批试验

堆型艾美耳球虫早熟株免疫剂量600、800个／羽的重复试验结果见表3。由表3可知，各免疫组在免疫期间的增重与不免组相当；攻虫后，两个免疫组的增重与健康对照组差异不显著（P＞0.05），均明显高于不免疫攻虫组（P＜0.05）。在肠道病变记分方面，两个免疫组均未出现病变，明显低于感染对照组。在卵囊产量方面，两个免疫组的卵囊减少率均在88%以上。结果再次表明，用堆型艾美耳球虫早熟株600个／羽和800个／羽免疫后均可获得良好的免疫保护效果。

表3 堆型艾美耳球虫早熟株不同免疫剂量重复试验保护效力Table3 The effectiveness of different immunizing dosages with precocious line of E.acervulina（Repeated）.

3 讨论

球虫感染宿主后可在体内诱导产生保护性免疫反应。自然感染中，鸡球虫的免疫原性主要在裂殖生殖阶段，尤其是第2代裂殖生殖阶段，而有性生殖阶段几乎没有免疫原性。对于堆型艾美耳球虫，主要是在第2代裂殖生殖阶段诱发机体产生大量免疫力［7］。与母株相比，堆型艾美耳球虫早熟株的生活史中缺少第3、4代裂殖子［8］。因此，堆型艾美耳球虫早熟株在不影响其免疫原性的基础上通过减少配子体和卵囊形成数量而降低致病性。本试验以母株作为对照，对堆型艾美耳球虫早熟株的免疫原性进行了研究，结果显示，该早熟株的免疫原性与同等剂量的母株相当，表明其保持了良好的免疫原性，这与已有的研究一致［7］。

鸡感染球虫后，对同种球虫再感染获得部分保护力。但球虫诱发宿主免疫力强弱、持续时间长短随种类的不用而异，基本取决于各自的生物学特点。研究表明，堆型艾美耳球虫的免疫原性介于巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫之间，可使鸡产生足够的免疫保护力。但堆型艾美耳球虫不同株之间存在遗传变异，说明其不同株之间的免疫原性存在着明显差异。为了研制球虫活疫苗，需要对疫苗虫株的推荐免疫剂量进行研究。已有研究表明鸡获得的保护性免疫效果与球虫的免疫剂量存在相关性。免疫剂量越大，其抗攻击能力越强，但免疫剂量过大，则导致肠上皮细胞大量损伤而难以在短时间内恢复，影响饲料的转化率和经济效益；免疫剂量过小，使基础免疫量减少，不能有效的刺激机体产生足够的免疫力抵抗大剂量的攻虫，容易造成疫苗反应加剧或球虫病暴发［8］。因此，需要在不同免疫剂量之间找到推荐免疫剂量。但由于至今尚无判定球虫推荐免疫剂量的统一标准，不同研究者采用的判定指标不同。华绍桂等［9－10］以成活率、费用、料重比、均重、饲料指数等5项指标，Long P L等以增重和病变记分等2项指标，本试验选用增重、病变记分和卵囊减少率等3项指标作为判定指标。

试验结果表明，用堆型艾美耳球虫早熟株和母株免疫雏鸡后都能产生一定的保护能力，攻虫后二者的指标规律性一致。比较二者增重，发现100个／羽～200个／羽小剂量免疫时，增重明显低于健康对照（P＜0.05）；用400个／羽～2 000个／羽免疫时，除了母株2000个／羽的增重明显低于健康对照组之外，其余各组均与健康对照组相当（P＞0.05）。这可能是100个／羽和200个／羽免疫剂量过小，不能使鸡产生足够的基础免疫力；免疫母株2 000个／羽对免疫鸡具有较强的致病作用，其生长受到影响，由于早熟株的致病性弱于母株，其对免疫鸡只的增重影响较小。在攻虫后，400个／羽～2 000个／羽各免疫组的卵囊减少率都超过90%，各组病变记分均轻于感染对照组，表明鸡只免疫后能获得较高的免疫保护力。在400个／羽～2 000个／羽免疫组中，综合增重、病变记分和卵囊减少率三个判定指标，600个／羽和800个／羽的免疫组效果最好。低于或者高于该免疫剂量都使增重和卵囊减少率呈下降趋势。综合考虑到一个好的疫苗应该是低剂量免疫、重复感染、保护效果好、副作用少、成本低等因素，建议将600个／羽作为堆型艾美耳球虫早熟株的推荐免疫剂量，该剂量也与已有研究基本一致。McDougald L R等［11］研制的堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫三价疫苗中，堆型艾美耳球虫的免疫剂量为500个／羽。国外商品化球虫疫苗Paracox®中，堆型艾美耳球虫的免疫剂量为500个／羽～650个／羽。

本文研究了实验室诱导的堆型艾美耳球虫早熟株不同免疫剂量的保护效果，初步拟定了制作疫苗的推荐免疫剂量，为研制球虫疫苗提供参考。但该剂量是在实验室条件下用单个虫株对笼养鸡只进行免疫获得的，该虫株与其他虫种复配后制成疫苗的免疫保护效果还有待进一步研究。

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