林秀蓉，陈巧绘，林 海

(本文编辑:张仲书; 英文编辑:王建东)

慢性丙型肝炎10年内约有20%发展成肝硬化，而肝硬化患者每年约3%发展为肝细胞癌，因此丙型肝炎的快速分型与诊断是临床科学治疗的前提和基础［1］。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)属黄热病毒科，为单股正链RNA病毒，约9600个核苷酸，具有高度多态性和变异性，根据基因序列的同源性可分为不同的型和亚型［2］。Simmonds提出并根据HCV的5'-NCR区序列的差异，建立了HCV基因组序列的分型方法，将HCV分为6种基因型和30几种亚型［3］。在此分型方法的基础上，目前已报道的基因型有11个，亚型超过70种。我国主要以基因型1b为主，2a次之，3b在华南和西南地区流行，6a主要流行于港澳地区［4-5］。本研究针对国内检测较多的3种基因型分别设计TaqMan-MGB探针，将RNA逆转录为cDNA后，再利用探针进行分型，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 2010年8月至12月收集来自福建某医院HCV-RNA阳性血清40例，其中男24例，女16例，年龄15～65岁，静脉采血4 ml于30 min内分离血清，－20℃冻存备用。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 主要仪器 ABI公司7500型 realtime-PCR仪，TGL-16G低温高速离心机，新加坡ESCO 4A-4A1生物安全柜。

1.2.2 主要试剂 HCV-RNA定量试剂盒购于南京冯阳生物技术公司，SuperScriptTMⅢ第一链合成试剂盒、RT-PCR试剂盒购于Invitrogen公司，探针及反应预混液购于上海基康公司。

1.2.3 探针及引物序列 对从美国国立生物技术信息中心(NCBI)下载的HCV基因序进行比较和筛选，用Express 2.0设计基因探针(表1)。

1.3 方法 针对三型常见的丙型肝炎基因型，分别设计 TaqMan探针，在探针的 5'分别标记 FAM(FAM-1b，FAM-3b)、VIC(VIC-2a)，3'标记萃灭基因TAMARA和MGB基因。检测时每一个样品分两管进行，第一管加入FAM-1b和VIC-2a，第二管加入FAM-3 b和VIC-2a，将VIC设置为绿色，FAM-1 b设置为红色，FAM-3b设置为棕色，扩增结束后，根据读取的扩增曲线快速分型(图1)。……