金 华，邹吉祥，宋春凤，李长田，朴仁哲**

（1.大连民族学院，辽宁大连，116600；2.延边大学农学院，吉林延吉，133000；

3.大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连，116622；4.吉林农业大学中药材学院，吉林长春，130118）

金针菇 （Flammulina velutiper）又名毛柄小火菇、构菌、朴菇、冬菇、朴菰、冻菌、金菇、智力菇等，隶属真菌门，担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口磨科，金钱菌属[1]。金针菇是中国主要栽培食用菌之一，分为黄色和白色2大品系[2-3]，有表现野生型的黄褐色菌株，突变的纯白菌株和一系列中间颜色的浅黄菌株[4]。金针菇味道鲜美,营养丰富 ,是著名的食药两用菌，有 “益智菇 ”等美称 ,具有很高的开发价值和广阔的前景[5]。它广泛分布于中国、日本、俄罗斯、欧洲、北美洲、澳大利亚等地均有分布。在中国北起黑龙江，南至云南，东起江苏，西至新疆均适合金针菇的生长[6]。ITS序列是真菌基因组rDNA的内转录间隔区，位于18S和5.8S rDNA以及5.8S和28S rDNA之间，在物种属内、近缘属间乃至科内系统进化关系研究中有一定的价值[7]。ITS适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析[8]。目前国内外对利用ITS序列分析鉴定金针菇的研究报道较少，本研究通过真菌核糖体ITS1和ITS4通用引物对不同品种、不同来源的金针菇材料PCR扩增，进行ITS序列分析，并通过在GenBank中的金针菇ITS序列进行比较，旨在从分子水平上鉴定金针菇亲缘关系，为金针菇菌株的区分鉴定、遗传多样性分析和种质资源评价提供技术依据。

表1 供试材料编号及产地

1 材料与方法：

1.1 材料

所用材料为河南驻马店市金针菇和吉林延吉地区的金针、金白、日金三个金针菇样品，将各金针菇样品ITS序列提交NCBI，并获得登录号，另有5个金针菇的ITS序列来自GenBank。

1.2 方法：

1.2.1 DNA提取：

采用改良的SDS法提取DNA将提取的DNA，置于-20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 PCR扩增ITS区段：

采用真菌 ITS序列的通用引物ITS1（5′-TCCGTAG GTGAACCTGCGG-3′） 和 ITS4（ 5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′）对样品进行扩增。PCR反应体系：用 25μl PCR 反应体系：2.5μl 10×PCR buffer(Mg2+)、 2μl dNTP(各 2.5 mmol·L-1)、 引物分别加入 0.5μl(10 μl·L-1)、0.5μl Taq DNA 聚合酶 (5U·μl-1)、 0.5μl DNA 模板，用水补至25 μl。PCR扩增条件：94℃预变性2 min，94℃变性40 s秒，52℃复性1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃保温5 min，4℃保存。将PCR产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3 ITS区段克隆及测序：

将扩增出来的核酸片段在上海生物工程公司纯化后测序。其中吉林省延吉市的3个金针菇样品测序图重叠峰严重，为查明原因，通过上海生物工程公司克隆测序，每个样品测6个克隆。

1.2.4 ITS序列分析及系统发育树构建：

将测序结果通过ClustalVersion2.1软件、BLAST工具和DNAMAN软件配合手动排序，分析G+C含量和变异位点，并在GenBank注册，所得序列号见表1。利用MEGA 5.0软件进行系统发育分析比对分析，并以自展法 (boot strap)进行检测，共循环1 000次，采用邻接法构建系统发育树 (Neighbor joining tree)。使用MEGA5.0中的Maxi mum Composite Likelihood模型构建序列遗传距离矩阵。

2 结果与分析：

2.1 ITS序列长度与GC含量分析：

所有供试材料ITS总长度在712-719bp范围内 (见表1)，G+C含量为49.4%~49.9%。其中ITS1在244 bp~249 bp范围内，G+C含量为47.2%~48.0%；ITS2在308 bp~311 bp范围内，G+C含量为52.1%~53.6%。5.8S rDNA进化过程中高度保守[8，12~14]，所以不做分析。分析表明，金针菇ITS区G+C含量变化较小，ITS2的长度和G+C含量均大于ITS1。

2.2 ITS序列突变位点分析：

对吉林地区金针菇样品的测序图进行检查，发现重叠峰严重，在ITS序列中存在碱基的插入或缺失的情况。为研究碱基的变异情况，对样品的PCR产物进行克隆测序，对测序结果比对分析。分析表明，吉林地区金针菇共有13个突变位点，其中，样品1、样品2、样品3的突变位点分别为：8个、8个、11个，说明其序列均没有同步进化，而其他六个金针菇样品各自进化比较稳定。

2.3 ITS排序及序列位点的分析：

通过clustalx1.83对序列进行排序，结果所有序列共有35个位点发生变异，其中可用于分析的信息位点13个，ITS1区有8个，ITS2区有5个 (见表3)。

ITS区共有变异位点35个；信息位点13个，占总变异位点的37.14%。其中ITS1有21个变异位点，8个变异信息位点，占总变异信息位点的61.54%，ITS2有13个变异位点，5个变异信息位点，占总变异信息位点的38.46%。ITS2的变异信息位点数高于ITS1。

碱基变异类型有C-T和G-A转换，C-A颠换，缺失变异，T→C转换5个，占38.46%；A→G转换有2个，占15.38%；C→A颠换1个，占7.69%；有5个缺失位点占38.46%，说明碱基变异类型以转换为主。

2.4 金针菇ITS序列遗传距离分析：

采用MEGA5.0根据Maximum Composite Likelihood参数分析得到序列间遗传距离 (见表3)。9个金针菇样品的平均距离为0.005。遗传距离最大为0.014，样品1、样品2、样品 3、样品 4、样品 5之间的遗传距离最小，为0.000，说明它们的ITS序列为同源序列。其余样品遗传距离均小于0.1，说明它们亲缘关系较近，表示其遗传分化可能发生很晚或者种群间的基因流动发生频繁。

表2 吉林地区3个金针菇材料ITS序列突变位点的比较

表3 供试材料ITS的变异信息位点

表4 基于rDNA-ITS序列的遗传距离比较

2.5 系统发育树构建：

根据测序结果，利用MEGA 5.0软件构建NJ系统发育树，用靴带自展法 （Bootstrap）检验发育树，重复1000次，判断各分支处的可信度 (图1)。广东省广州市与其他样品处于树的两大分支上，说明ITS序列可用于鉴别金针菇的亲缘关系，其余8个样品中，吉林省延吉市 （金针）、吉林省延吉市 （金白）、吉林省延吉市 （日金）、河南省驻马店市、辽宁省大连市的金针菇样品在树的最小分支上，得到了Bootstrap值的有力支持 (57%)，表明这五个地区的金针菇在ITS区极其相似，但不能通过ITS序列区分吉林延吉地区的3个金针菇品种。

图1 基于ITS序列构建九个金针菇材料的NJ系统发育树

3 讨论

在进化过程中ITS序列所受到的选择压力非常小，能够允许更多的变异，进化速率较快，在大部分的真核生物中都表现出了极为广泛的序列多态性，能够显示种群内最近的进化特征[9]，且ITS序列分析受主观因素的影响较小[10]。ITS区序列已经应用于真菌中很多属种的鉴定及系统发育进化的研究，在揭示分布于不同区域的或间断分布种群的关系具有更大的潜力[11]。目前ITS序列对金针菇系统发育的研究较少，本文采用不同地区金针菇以及不同品种的金针菇为材料进行ITS序列分析，并与GenBank上的金针菇序列比较，发现ITS序列变异信息丰富，且主要集中在ITS2区域上，其中延边地区三个金针菇样品ITS序列重叠峰严重，通过克隆测序发现各品种间进化不同步[12]，ITS序列上正在发生变异，尚未形成显著差异，这可能是导致无法用ITS序列区分延边地区金针菇属3个品种的原因。根据NJ系统发育树判断，广东省广州市的样品与其他样品处于树的两大分支上，其余样品之间又出现很多分支，河南地区、辽宁地区和延边地区的3个金针菇样品处于同一个最小分支上，说明这3个地区的金针菇亲缘关系较近，可见，ITS序列能够鉴定金针菇的亲缘关系的远近。不同地区的环境差异对金针菇属的变异影响较大，其中某些地区金针菇属种类的ITS区变异较晚，单纯用ITS序列无法对所有金针菇种类进行有效的分类鉴定。ITS区变异丰富，对ITS区进行序列分析不仅丰富了真核生物核糖体基因ITS序列信息，而且为真菌分类鉴定及系统发育等研究提供了十分重要的资料和依据[13]，从而成为系统与进化研究中重要的分子标记，本研究也为将来的真菌亲缘关系分析提供了重要的理论依据。

然而以ITS序列作为分子标记应用技术的最大限制是，有的真菌由于进化顺序、变异、甚至分析方法等原因，在间隔区表现的差异性比较小，不适于属内种及种群的标记，这就得依赖于其他基因序列的有力补充。相信随着分子生物技术的发展，采用分子方法进行物种间分类、鉴定、亲缘关系的确定会更加精确。

[1]于荣利、秦旭升、宋凤菊.金针菇研究概况 [J].食用菌学报，2004.11 （4）：63-68.

[2]王波，彭卫红，甘炳成.金针菇33个菌株遗传多样性与组织分离菌株鉴定的酯酶同工酶分析 [J].西南农业学报，2008,21（2）：448-450.

[3]杨成香，张瑞颖,左雪梅，姜瑞波,李顺鹏.金针菇遗传多样性初步分析[J].中国食用菌，2007，26 （4）：37～39.

[4]蚁瑞荣，曹晖、潘迎捷.金针菇单核出菇与子实体颜色 [J].食用菌学报，2007.14 （2）：33-36.

[5]宋冬灵、曾宪贤、吕杰等.金针菇遗传育种研究进展 [J].种子，2007,26 （5）：52-54.

[6]黄晨阳.同工酶和RAPD标记在金针菇菌株鉴定和遗传多样性研究中的应用[D].福建.福建农林大学，2002:1-33.

[7]郑和斌，王作仁，吕作舟等．美味侧耳ITS序列直接测序与克隆测序比较分析[J]．食用菌学报，2005，12（1）：1-4.

[8]陈剑山，郑服丛.ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用[J].安徽农业科学，2007，35 （13）：3785-3786.

[9]郑雪松，杨虹，李道棠等．基因间隔序列在细菌分类鉴定和种群分析中的应用[J]．应用与环境生物学报，2003，9（6）：678-684．

[10]刘娜娜.黄杨属部分植物nrDNAITS序列测定及亲缘关系分析[D].南京林业大学，2010:1-75.

[11]基于rDNA-ITS序列分析对10株野生桑黄菌属、种鉴定及其系统发育进化的研究[D].西北农林科技大学，2010:1-36.

[12]Mao SHIBA，Kenji KONDO，Eiji MIKI，et al.Identi cation of Medicinal Atractylodes Based on ITS Sequences of nrDNA.[J].Biol.Pharm.Bull，2006，29(2)：315-320.

[13]陈凤毛.真菌ITS区序列结构及其应用 [J].林业科技开发，2007，21 （2）：5-7.