钱静亚，张志才**，黄达明，崔凤杰，郑惠华，陈 惠

(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江212013；2.江苏安惠生物科技有限公司，江苏 南通226009)

糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病，如何提高中药的作用效果已成为糖尿病治疗的重要问题。微生物尤其是药用真菌转化中药为提高中药治疗糖尿病的效果提供了新的方向。1992年，南京中医药大学庄毅提出 “药性菌质”的概念，建议用中草药和营养基质为原料，用药用真菌固体发酵，发酵完成后得到的基质、菌丝体、代谢产物的混合物称为菌质，作为中药[3]。1994年、1995年和2001年又提出 “药用菌新型固体发酵工程技术”这一概念[4]。2001年，江南大学章克昌教授提出了 “药用真菌生物转化中药”的概念，即药用真菌转化一种或多种中药，同时提高药用真菌和中药的功效或产生新的疗效降低中药毒性[5]。同年，王兴红等提出利用微生物强大的分解转化物质的能力，通过微生物的生长代谢和生命活动来炮制中药，以更大幅度地增加中药的的利用度，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症[6]；吴炳新等提出以优选的有益菌群中的一种或几种、一株或几株益生菌作为菌种，加入中药提取液中，再按照现代发酵工艺生产出含有中药活性成分、菌体及其代谢产物的全组分发酵液的新型中药发酵加工制剂[7]。

鸡腿菇 （Coprinus comatus）鲜菇中含有多种生物活性物质，具有多种生理、药用及保健作用[9－10]，民间用其治疗糖尿病。丁重阳等还从鸡腿菇发酵液中分离出一种多酚类化合物4,5－二羟基－2－甲氧基苯甲醛，这种活性成分具有显著降血糖作用[11]。而桑叶富含具有降血糖、降血脂等的多糖、黄酮、生物碱等活性成分[12－14]，这些桑叶中的活性成分添加到发酵液中进行转化有可能提高鸡腿菇发酵液的活性成分含量，增强鸡腿菇发酵液的功效。而王锋等[15]在鸡腿蘑发酵液中添加不同中药进行液体培养，以四氧嘧啶诱发的糖尿病小鼠模型进行降血糖试验，结果表明添加苦瓜的鸡腿蘑发酵液有显著降血糖作用。因此，本文研究鸡腿菇转化桑叶发酵液的降血糖作用，证明鸡腿菇转化桑叶发酵液可比单一鸡腿菇发酵液或桑叶更好地降低糖尿病小鼠的血糖值，并通过测定模型小鼠的生理生化指标以及体重变化等情况，初步分析鸡腿菇转化桑叶发酵液在模型小鼠体内的降血糖作用机理。本研究不仅为药用真菌生物转化中药提供了参考，对于开发新的中药治疗糖尿病也具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

鸡腿菇JS－09购于中国农业科学研究院菌种保藏中心

1.1.2 动物

雄性昆明小鼠，6周龄，，购自南京江宁实验动物中心，合格证号：SCXK苏20020018

1.1.3 培养基

麸皮固体培养基：麸皮:水=1:1

马铃薯葡萄糖 （PG）培养基：马铃薯200g，葡萄糖20 g，水1 000 mL

1.2 方法

1.2.1 鸡腿菇发酵液、鸡腿菇转化桑叶发酵液及其浓缩物的制备

鸡腿菇接种于灭菌后的麸皮固体培养基中，27℃恒温培养7 d；将麸皮培养基中的菌种转接于灭菌后的马铃薯葡萄糖 （PG） 培养基中， 25℃，160r·min－1振荡 （往复式摇床，镇江格瑞生物工程公司）培养3 d；将已培养好的一级菌种以体积分数10%的量接种到PG液体培养基中，25℃，160r·min－1振荡培养7 d，即得鸡腿菇发酵液；将一级菌种以体积分数10%的量接种到PG+0.6%桑叶液体培养基中，25℃，160r·min－1振荡培养7 d，即得鸡腿菇转化桑叶发酵液，真空减压浓缩，冷冻干燥，即为发酵液浓缩物，收率为 16.53g·L－1。

1.2.2 桑叶提取液的制备

0.5 g桑叶用100mL水高压锅120℃，30 min提取。

1.2.3 糖尿病模型小鼠的建立及小鼠分组

小鼠 （在通风、干燥、每天12 h光照、室温18℃～22℃和湿度30%～50%动物房中，适应性喂养5 d，选择10只作为正常对照组。其余禁食24 h，腹腔注射180 mg·kg－1体重新配制的四氧嘧啶造糖尿小病鼠模型。饲养5d后禁食5 h，尾部静脉采血测定血糖，选取血糖值＞13mmol·L－1的小鼠作为实验性糖尿病模型鼠。将四氧嘧啶诱导的高血糖模型小鼠分成5组，每组10只，分为模型对照组、纯鸡腿菇发酵液组、桑叶提取液组、鸡腿菇转化桑叶发酵液组每天按10 mL·kg－1体重剂量灌胃1次，连续灌胃 7 d后，禁食4 h，眼框静脉采血测定血清中血糖含量。糖尿病模型小鼠建立方法参照前面，将四氧嘧啶诱导的高血糖模型小鼠分成7组，每组10只，分为模型对照组、二甲双胍组 （阳性药物对照组）、鸡腿菇转化桑叶发酵液组（五组，浓缩物灌胃剂量分别为：5 mg·kg－1、 10 mg·kg－1、20 mg·kg－1、 40 mg·kg－1和 80 mg·kg－1体重）。

1.2.4 小鼠生理生化指标的测定

正常组、模型对照组、二甲双胍组和鸡腿菇转化桑叶发酵液组继续灌胃14 d后，用乙醚麻醉，眼眶采血，血液样品经10 000×g，4℃离心 （BR4冷冻离心机 BR4i， 法国JOUAN公司）10min得血清 （John&Anne－Marie 2002），分析血清中的血糖值、果糖胺 （果糖胺试剂盒，南京建成生物工程研究所）、总胆固醇 （TC）和甘油三酯 （TG），其中TC和TG的分析由相应试剂盒 （北京中山生物技术有限公司）进行分析。

将采完血的小鼠迅速解剖，分离肝脏、肾脏，低温离心制备组织匀浆上清液，分别测定肝脏、肾脏组织匀浆上清液中超氧化物歧化酶 （SOD）活性。SOD测定采用试剂盒 （南京建成生物工程研究所）法，操作步骤按试剂盒说明进行。

1.2.5 鸡腿菇发酵液、鸡腿菇转化桑叶发酵液中成分的测定

黄酮含量的测定采用亚硝酸钠－三氯化铝法，以芦丁制作标准曲线；多酚含量的测定采用福林酚法，以没食子酸制作标准曲线；多糖的测定采用苯酚硫酸法。

1.2.6 统计方法

试验数据采用SPSS14.0统计软件进行方差分析，试验数据以均值±方差 （mean±SD）的形式表示。各组间试验数据比较采用单因素单尾方差分析。P＜0.05表示组间差异达到显著水平；P＜0.01表示组间差异达到极显著水平。

2 结果

2.1 纯鸡腿菇发酵液、桑叶提取液和鸡腿菇转化桑叶发酵液对糖尿病小鼠血糖的影响

纯鸡腿菇发酵液、桑叶提取液和鸡腿菇转化桑叶发酵液对糖尿病小鼠血糖的调节作用见表1。与正常对照组相比，其它试验组的血糖都显著提高。各模型组之间血糖值无显著差异 （P＞0.05），说明模型鼠是稳定可用的。和模型对照组相比，纯鸡腿菇发酵液组、桑叶提取液组和鸡腿菇转化桑叶组血糖值显著低于模型对照组 （P＜0.01），说明这三种供试样品以10 mL·kg－1体重剂量灌胃能产生显著降血糖作用。试验后鸡腿菇转化桑叶组的血糖显著低于桑叶提取液组和纯鸡腿菇发酵液组，说明鸡腿菇转化桑叶提取液提高了单一鸡腿菇发酵液或桑叶提取液的降血糖作用，因此选择鸡腿菇转化桑叶组作进一步研究。

表1 纯鸡腿菇发酵液、桑叶提取液和鸡腿菇转化桑叶发酵液对糖尿病小鼠血糖的影响

2.2 鸡腿菇转化桑叶发酵液试验剂量的确定

糖尿病小鼠喂食不同剂量鸡腿菇转化桑叶发酵液浓缩物后结果见表2，鸡腿菇转化桑叶发酵液对糖尿病小鼠血糖的调节作用呈剂量依赖性关系，在低剂量范围内作用不显著，而当剂量大于10 mg·kg－1体重时，血糖显著降低。在剂量大于20 mg·kg－1体重时，不仅血糖有显著降低，而且血清中果糖胺指标有极显著差异，由于果糖胺可以反应近15 d的血糖值，因此综合这两项指标，选择鸡腿菇转化桑叶发酵液浓缩物剂量为 20 mg·kg－1体重作进一步研究。

2.3 鸡腿菇转化桑叶发酵液对血脂代谢的影响

不同处理组小鼠的血脂值如表3所示。模型对照组小鼠甘油三酯极显著高于正常对照组 （P＜0.01），而鸡腿菇转化桑叶发酵液组甘油三酯与模型对照组有极显著差异（P＜0.01），同时与二甲双胍组相比也有显著差异 （p＜0.05），说明鸡腿菇转化桑叶发酵液能极显著的降低糖尿病小鼠血清中甘油三酯含量，作用效果显著优于二甲双胍；另外，鸡腿菇转化桑叶发酵液组胆固醇值与模型对照组相比无统计学差异 （P＞0.05），表明鸡腿菇转化桑叶发酵液对糖尿病小鼠血清中总胆固醇含量无明显影响。

表2 不同剂量的鸡腿菇转化桑叶发酵液对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的作用

表3 不同处理组血清中血脂的比较

2.4 鸡腿菇转化桑叶发酵液对超氧化物歧化酶 （SOD）活性的影响

SOD是一种广泛存在于生物体内与细胞氧化代谢密切相关的蛋白质，是活性氧自由基的天然消除剂，也是抗氧化酶系中最先与活性氧自由基结合的酶类。SOD能特异性结合体内超氧阴离子，且可与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)协同作用防止脂质过氧化及其代谢产物对机体的损害[16]，还可直接捕捉和清除超氧阴离子等自由基[17]。

表4 不同处理组肝脏和肾脏中超氧化物歧化酶活性的比较

由表4可知模型对照组糖尿病小鼠肝脏和肾脏中SOD酶活性显著低于正常对照组 （P＜0.05），而鸡腿菇发酵液组中SOD酶活性显著高于模型对照组 （P＜0.01），这说明鸡腿菇发酵液可以显著提高糖尿病小鼠的体内抗氧化能力，从而可降低糖尿病小鼠体内因长期的氧化应激对组织器官造成的氧化损伤。

2.5 鸡腿菇转化桑叶发酵液对丙二醛的影响

丙二醛 (MDA)为体内脂质氧化终产物，它能使蛋白质、核酸、脂类发生交联，使生物膜变性、细胞突变、衰老或死亡。MDA也是反映氧化损伤的指标之一，其生成量随氧自由基生成的增加而增加[18]。

表5 不同处理组血清中丙二醛含量的比较

不同处理组小鼠血清中丙二醛含量见表5。模型对照组糖尿病小鼠的血清中丙二醛含量明显高于正常对照组小鼠 （P＜0.05），从另一方面说明糖尿病小鼠造模成功，鸡腿菇转化桑叶发酵液组糖尿病小鼠血清中丙二醛含量极显著低于模型对照组 （P＜0.01），这表明鸡腿菇转化桑叶发酵液具有明显的降低体内脂质过氧化的功效，从而减轻细胞损伤的程度。

2.6 对小鼠体重的影响

表6 各组实验小鼠体重变化

由表6知，试验前各组间体重无显著差异 （P＞0.05），说明各组体重具有可比性。试验后，模型对照组糖尿病小鼠体重明显比正常小鼠体重低，而鸡腿菇转化桑叶发酵液组糖尿病小鼠体重显著高于模型对照组 （P＜0.01），说明鸡腿菇转化桑叶发酵液可以减少糖尿病小鼠体重下降。

2.7 转化前后鸡腿菇发酵液成分分析

黄酮类化合物可通过抗氧化、维护生物膜稳定，保护胰组织、调节与糖代谢有关酶类的释放及其活性、干扰小肠对糖的吸收、使餐后血糖峰值后移与降低、胰岛素样作用、促进外周组织利用糖、调整糖代谢、抗胰腺炎炎症损伤、抑制醛糖还原酶和抑制蛋白糖基化等抗糖尿病及其并发症[19]。而多酚类化合物具有清除自由基，提高机体抗氧化能力的显著作用，具有一定辅助预防和治疗糖尿病功效。

表7 转化前后鸡腿菇发酵液成分分析

从表7中可以看出，桑叶的成分改变了鸡腿菇中成分的组成，鸡腿菇转化桑叶发酵液中小分子活性物质黄酮和多酚类化合物含量增加，而大分子物质多糖含量则降低。

通过C－18柱层析和HP－20柱进一步分离鸡腿菇转化桑叶发酵液，得到一种具有抑制蛋白质非酶糖基化活性的物质，综合质谱、红外光谱和核磁图谱数据分析该化合物结构为4,5－二羟基－2－甲氧基苯甲醛，结构图见图1。丁重阳等研究发现该成分具有显著的调节血糖作用[11]，含量分析显示，没有添加桑叶的鸡腿菇发酵液该成分含量为1.62 mg·mL－1，添加桑叶后的鸡腿菇发酵液该活性成分含量为 2.52 mg·mL－1。

图1 4,5-二羟基-2-甲氧基苯甲醛结构图

3 讨论

我国利用中医药在糖尿病的预防和治疗上已经积累了丰富的经验，随着药用真菌生物转化中药技术的出现与发展，传统中医药与现代生物工程发酵技术结合而形成的高科技中药制药新技术将大大推进中药防治糖尿病的应用进程。

鸡腿菇转化桑叶的发酵液比单一鸡腿菇发酵液或桑叶更好地降低了糖尿病小鼠血清中的血糖值，通过测定甘油三酯、总胆固醇、丙二醛以及超氧化物歧化酶指标，发现鸡腿菇转化桑叶的发酵液不仅降低了甘油三酯、丙二醛含量，同时提高了脏器中超氧化物岐化酶活性。转化后的发酵液中黄酮类化合物含量以及多酚类化合物含量均有所增加，说明转化后发酵液的抗氧化及抗自由基的功效都有所增强，另外，具有血糖调节作用的4,5－二羟基－2－甲氧基苯甲醛含量也有所提高，这些为鸡腿菇转化桑叶发酵液的降血糖作用提供了坚实的理论支持。糖尿病患者体内自由基产生过多，机体抗氧化防御作用减弱，体内自由基不能被完全清除而积累。自由基性质活泼，又极易与其他物质发生反应而形成新的自由基或活性氧类氧化物，而且反应往往呈连锁性。自由基的这种强氧化作用使其所参与的反应直接或间接地对机体造成危害，其主要损伤反应包括蛋白质氧化、DNA突变甚至断裂、脂质氧化、细胞膜起泡等一系列糖尿病并发症。而鸡腿菇转化桑叶的发酵液可能就是通过提高肌体抗氧化能力和清除自由基而达到降血糖的目的。

张志才等用猴头菌对银杏叶粗提物EGB进行转化，结果发现猴头菌转化EGB的发酵液对2型糖尿病的血糖调节作用比未转化的发酵液显著提高[20]，而鸡腿菇转化桑叶的发酵液也证明其降血糖作用进一步增强，这些研究为药用真菌生物转化中药提高作用效果提供了借鉴，推动了药用真菌生物转化中药治疗疾病的深入研究。

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