刘 巍，范 开

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(简称TNHH)系由大肠杆菌重组表达，经纯化精制而得的具有国内外创新性研究成果的注射药物。应用该工艺制备的TNHH理论氨基酸数为283个，理论相对分子质量为31525.5 D，理论等电点(PI)为4.57。由TNHH的氨基酸序列可知，在其结构中含有10个半胱氨酸，形成5对二硫键，因此，在制备工艺中存在因二硫键错配而形成的异构体。为了进一步去除异构体，本研究采用适宜的质控方法(RP-HPLC法、等电聚焦、非还原型SDS-PAGE凝胶电泳法、非变性PAGE法、活性分析、阴离子交换HPLC分析异构体)对异构体鉴定和含量比例进行控制。首先制备TNHH异构体并进行分析鉴定，在此基础建立一种质控方法分析并测定本品中异构体的最低限量，以达到TNHH中异构体含量不高于5.0%的国家生物药物异构体质量控制标准。

1 仪器和材料

1.1 仪器

Amersham Bioscience纯化仪(美国GE);Waters 600-2487系统液相色谱仪(美国Waters);Bio-Rad Universal电泳仪(美国Bio-Rad);Source 30Q预装柱(美国 GE);PL-SAX 1000A，8 μm，150 ×4.6 mm(美国Polymer Laboratories);SourceTM15Q，10×50 mm，15 μm(美国 Pharmacia);TU-1810 紫外可见分光光度计(北京普析);Spectra Max190酶标仪(美国MD);HHS-4S型电子恒温水浴锅(上海南阳);冷冻干燥机(Labconco);PHS-3C型PH计(上海大普);透析袋(Green Bird)。

1.2 材料

磷酸氢二钠(AR，上海生工);磷酸二氢钠(AR，上海生工);硫酸铵(AR，上海生工);乙酸钠(AR，上海生工);冰乙酸(AR，广东光华);乙腈(AR，广东光华);三氟已酸(AR，广东光华);蛋白Marker(北京天恩);凝血酶标准品(中国药品生物制品检定所);纤维蛋白原纯品(美国Sigma)。

2 方法

2.1 TNHH异构体的制备

采用原液制备工艺路线中Source 30Q层析分离TNHH不同异构体。试剂配制:A液为20 mM PB，0.2M(NH4)2SO4，pH 值为 8.0;B 液为 20 mM PB，0.4M(NH4)2SO4，pH 值为 8.0。……