● 黄远鹏 李 楠 杜 江 李奕修 王和鸣

骨性关节炎(ostcoarthritis，OA)，又称骨关节病，肥大性关节病，增生性关节病，是一种以软骨外基质缺失及异常重建的退行性疾病［1－2］。其结构性变化特征包括:逐渐丧失关节软骨，在关节边缘骨赘的形成和软骨下骨囊肿的发展［3－5］。OA在中医理论中属于“痹证”中“骨痹”范畴，以肝肾亏虚为其根本，故治疗上，补肝肾之虚，扶正固本为其治疗原则。临床研究中发现，龟鹿二仙胶能够有效的减轻OA患者的症状，改善其关节功能［6］。前期研究发现，龟鹿二仙胶能够有效的促进SD大鼠及豚鼠软骨细胞的增殖，抑制SD大鼠软骨细胞的凋亡，能够促进豚鼠软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成［7－9］，验证了龟鹿二仙胶的补虚作用对OA的影响。本实验针对人参枸杞在方中配伍的意义而设计，具体报道如下。

1 材料

1.1 主要试剂 DMEM培养基(低糖)、PBS缓冲液、胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone)、Ⅱ型胶原酶(Sigma)、兔超敏二步发免疫组化检测试剂盒、浓缩型DAB染色试剂盒(中衫金桥)、Rabbit Anti－Collagen Type II(Abcam)。

1.2 主要仪器设备 二氧化碳培养箱(Heal Firce公司212 UV型)、超净工作台(苏净安泰)、倒置显微镜(OLYMPUS IX70型)、万能研究级显微镜(OLYMPUS)、显微图像处理系统(Motic Imges Advance 3.2)、数码医学图像分析系统(Motic Med 6.0)(麦克奥迪)。

1.3 实验动物 健康1月龄清洁级雄性Wistar大鼠50只，体重190～210g，实验动物许可证号:SCXK(沪)2007－0005;合格证号:0069141。3月龄清洁级豚鼠4只(实验动物许可证号:SCXK(沪)2007－0005)，以上动物均由上海斯莱克实验动物有限公司提供。

1.4 实验药物 龟鹿二仙胶由龟甲胶(1∶1)、鹿角胶(1∶1)、人参(1∶5)、枸杞(1∶3)四味中药组成，均为农本方中药配方颗粒，生产批号:龟甲胶A101209－01，鹿角胶 A100010－01，人参 A101134－02，枸杞A100873－02。

2 方法

2.1 动物分组 雄性Wistar大鼠50只，适应性喂养3天后，随机分为5组，每组10只:分别为生理盐水(对照)组、龟鹿二仙胶(全方)组、龟板鹿角(龟鹿)组、龟板鹿角人参(龟鹿参)组、龟板鹿角枸杞(龟鹿杞)组，苦味酸标记。

2.2 药物制备 参照《中医骨伤科学基础》教材，按照龟板9g、鹿角6g、人参6g、枸杞9g的配伍比例定为人的用药剂量，大鼠给药剂量根据人与大鼠按体表面积换算的药物等效剂量换算公式［10］计算，得出以下给药剂量:

表1 各味中药换算后的剂量［g/只(200g)］

2.3 动物给药及含药血清的制备 对照组予相应剂量的0.9%氯化钠溶液，连续给药7天，每日清晨一次，每次3ml，最后一次灌药(灌药前禁食不禁水12小时)一小时后腹主动脉采血，3000r/min离心15分钟，取上清，56℃水浴灭活30分钟，0.22μm微孔滤膜过滤分装、标记，－80℃保存备用。

2.4 软骨细胞分离及培养 3月龄豚鼠处死，消毒，取出膝关节，在超净台上分离关节软骨面，切取软骨，将关节软骨剪成约1mm3大小，PBS漂洗，37℃ 5mL 0.2%Ⅱ型胶原酶消化45min，取上清，离心收集细胞，重复4次，将细胞悬液稀释为2×105个/mL，接种于25cm2培养瓶，加含10%FBS的 DMEM培养基，置37℃培养箱培养。

2.5 免疫组化染色检测各组含药血清对豚鼠软骨细胞Ⅱ型胶原合成的影响 将F1代的细胞以1×104/ml的密度传代至铺有4%多聚赖氨酸盖玻片的24孔板中，24小时软骨细胞贴壁后，加入各组含10%含药血清的DMEM培养基培养48小时，每组4孔，制作细胞爬片，按照试剂盒说明书进行染色，检测各组Ⅱ型胶原含量。

2.6 图像分析 免疫组化染色标本均在万能研究级显微镜下观察，Motic Images Advance 3.2显微图像处理软件采集图片，每组标本随机选取6个视野，拍照保存，图片数据采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对图像进行分析，测定标本中阳性信号平均灰度值。

2.7 统计学分析 所有数据采用SPSS16.0软件进行统计分析，所有计量资料用均数±标准差(±s)表示，各组间比较采用单因素方差分析，成组数据比较采用 t检验，以 P ＜0.05表示有显著差异，P＞0.05表示无显著差异。

3 结果

免疫组织化学法检测各组含药血清对软骨细胞分泌Ⅱ型胶原的影响，见图1～6、表2。可见，五组均有阳性异染，Ⅱ型胶原阳性异染部位为胞浆，呈片状或团块状的棕红色颗粒染色。图中，胞核呈蓝紫色染色，是经苏木素复染的结果。其中，全方组异染颜色最深，对照组异染颜色最浅。表2显示，与对照组比较，四组含药血清均能明显的促进豚鼠软骨细胞合成Ⅱ型胶原(P＜0.05)。全方组药效高于其他四组(P＜0.05)，龟鹿参组与龟鹿杞组促Ⅱ型胶原合成能力明显优于龟鹿组(P＜0.05)，龟鹿杞组比龟鹿参组效果更佳。(P ＜0.05)。

表2 免疫组化染色检测各组软骨细胞Ⅱ型胶原合成的情况(n=6，±s)

表2 免疫组化染色检测各组软骨细胞Ⅱ型胶原合成的情况(n=6，±s)

注:与对照组比较:△P ＜0.05;与龟鹿组比较:▲P ＜0.05;与全方组比较:*P＜0.05;龟鹿参组与龟鹿枸组对比:P＜0.05。

组平均灰度值别全方组 141.40 ±1.378△▲龟鹿组 128.49 ±3.384△＊龟鹿参组 133.63 ±2.605△▲＊龟鹿杞组 135.23 ±5.498△▲＊对照组 116.27 ±5.805▲＊

4 讨论

骨性关节炎是一种以关节软骨损伤和骨质增生为特点的非炎症性疾病。其病理改变是关节软骨的病变。关节软骨由99%的软骨外基质和1%的软骨细胞组成，胶原蛋白是软骨基质中最主要的成分之一，约占成人关节软骨干重的2/3［11］。其中Ⅱ型胶原占90%以上，是软骨保持结构的紧密性和生物力学特性的基础。其合成及分解的动态平衡关系到软骨外基质的合成和降解平衡。因此Ⅱ型胶原的表达正常与否是衡量软骨细胞反分化和表型异常的重要依据。豚鼠软骨的降解与人类OA的发展非常相似［12］，3月后豚鼠关节面粗糙，中央呈现小颗粒并有轻度凹陷，软骨面无光泽，干燥呈微黄色［13］。因此，本实验取3月龄豚鼠软骨细胞作为研究对象。

注:图1－6为各组含药血清对豚鼠软骨细胞Ⅱ型胶原合成的影响(×200)

中医认为OA是受风、寒、湿三邪所致，加以肝血肾精亏虚，气血不足，筋骨失养，形体疲极而易发本病。龟鹿二仙胶具有温肾益精，补气养血作用。主治肾中阴阳两虚，任、督精血不足。其中鹿角胶补肾助阳、强筋壮骨，龟甲胶滋阴潜阳、养血补心，两者一温一寒，一阴一阳，合用能峻补阴阳以生气血精髓。人参大补元气，枸杞补肾益精。四药合用，为阴阳气血交补之剂，共具填补精髓、益气壮阳之功。

实验中，各药物组标本均呈现阳性表达，软骨细胞胞浆中呈现棕黄色颗粒或呈团块状。全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组对Ⅱ型胶原阳性染色比生理盐水对照组较深，全方组优于三组拆方组。与龟鹿组对比，龟鹿参组与龟鹿杞组效果较佳，其中龟鹿杞组药效更好。参照前期实验［7－9］，证实了君药龟板和鹿角在促胶原合成药效中发挥的作用，同时臣药人参与枸杞能够促进君药更好的发挥药效，具备明显的协同辅助作用。

有研究表明:枸杞提取液能显著提高小鼠皮肤中SOD的活性，增加皮肤中胶原蛋白的含量［14］。枸杞多糖可以通过抑制肾脏内IV型胶原的表达起到肾脏保护作用［15］。可见枸杞对胶原的影响根据不同组织出现不同的结果。但前期研究显示［9］，枸杞单独并不能有效的促进Ⅱ型胶原合成。可见枸杞在方中起促进君药龟甲、鹿角药效发挥的作用。其中人参虽然有促进效果，但是不及枸杞，其在方中作用有待进一步研究。

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