朱祥 马圭 祁卫东 蒋鹏程 范钰

（江苏大学附属人民医院肿瘤研究所 江苏镇江 212002）

Cripto－1基因最初是通过克隆人畸胎瘤细胞系中的互补DNA文库得到，故相应地命名为畸胎瘤衍生生长因子－1（teratocarcinoma－derived growth factor－1，TDGF1），定位在人类染色体3p21.3［1］，编码cripto蛋白，故一般称为Cr－1基因。研究发现，Cr－1基因在许多恶性实体瘤如结直肠癌、胃癌、胰腺癌、阴茎癌、膀胱癌及前列腺癌等中均呈过度表达，而它在正常组织中都不表达或低表达［2，3］。有研究发现，Cr－1基因与某些肿瘤如结直肠癌［4～8］侵袭有关。但国内目前尚无关于此基因在结直肠癌细胞侵袭方面的研究。

本课题组借助于RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，以化学合成Cr－1基因小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染处理结直肠癌SW480细胞，观察了Cr－1基因siRNA转染对癌细胞侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 人结直肠癌SW480细胞，本院组织生物标本库冻存。Cr－1抗体购自Santa Cruz公司。TRIzol，RNase inhibitor，逆转录酶SSRTⅡ，Taq酶和转染试剂Oligofectamine购自Invitrogen公司。

1.1.2 siRNA序列 根据Cr－1基因mRNA序列特点，设计合成了6个siRNA。另外，设计了一个错配 siRNA（正义 链：5＇－UUCUCCGAACGUGUCACGUTdTd－3 ＇； 反 义 链： 5 ＇－ACGUGACACGUUCGGAGAATdTdT－3＇）作为对 照。所有siRNA均由美国Dharmacon公司采用化学合成方法合成。Cripto－1siRNA序列见表1。

表1 Cripto－1siRNA 序列

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染处理 人结直肠癌SW480细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液、37℃、5%CO2、饱和湿度环境的条件下培养。转染前1天，将1.0×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板，1ml／well，培养过夜。次日进行转染。基本操作按说明书进行。细胞分组：（1）空白对照组（Con－A）：未经任何处理的结直肠癌细胞；（2）空载对照组（Con－B）：即脂质体对照组；（3）错配对照组（Scr－siRNA）；（4）siRNA 组：10%胎牛血清的 RBMI 1640中含不同浓度（3.125、6.25、12.5nmol／L）的已用脂质体包埋的siRNA。

1.2.2 结直肠癌细胞Cr－1基因检测