江德富 浙江省温岭市第二人民医院 台州 317500

童夏生 浙江省台州市中西医结合医院 罗冬娇 亢晓冬 杭州师范大学钱江学院

叶 辉 浙江省台州市第一人民医院 范广民 陈 琪 浙江省台州市中心医院

哮喘大鼠TLR1、FasL和TRAF2表达及甲基强的松龙干预作用

江德富 浙江省温岭市第二人民医院 台州 317500

童夏生 浙江省台州市中西医结合医院 罗冬娇 亢晓冬 杭州师范大学钱江学院

叶 辉 浙江省台州市第一人民医院 范广民 陈 琪 浙江省台州市中心医院

目的：探讨TLR1、FasL和TRAF2在大鼠哮喘炎症机制中的作用，观察甲基强的松龙对其表达的影响。方法：27只SD大鼠，随机分成哮喘模型组、正常对照组和甲基强的松龙组，每组9只，采用流式细胞术检测血淋巴细胞TLR1和FasL表达，免疫组织化学法检测肺组织TRAF2表达。结果：哮喘组血淋巴细胞TLR1表达水平显著低于甲基强的松龙组（P＜0.05），正常对照组血淋巴细胞TLR1表达水平分别与哮喘组及甲基强的松龙组比较，差异无统计学意义（P均＞0.05）。哮喘组和甲基强的松龙组血淋巴细胞FasL表达水平均显著高于正常对照组（P均＜0.05），而哮喘组血淋巴细胞FasL表达水平与甲基强的松龙组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。哮喘组TRAF2光密度值显著高于正常对照组和甲基强的松龙组（P均＜0.01），甲基强的松龙组TRAF2光密度值与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：哮喘模型大鼠FasL和TRAF2表达增加，而TLR1无变化；甲基强的松龙能下调TRAF2和提升TLR1水平，从而起到抗炎作用。

大鼠 哮喘 TLR1 FasL TRAF2 肿瘤坏死因子受体相关因子 糖皮质激素

炎症细胞和炎症因子在哮喘的发病机制中起着非常重要的作用，尤其是淋巴细胞在调节Th1/Th2平衡中起了决定性作用［1］。Toll样受体（TLR）是联系天然免疫与获得性免疫的重要分子，其信号系统可能通过诱导产生Th1和（或）Th2型细胞因子从而参与哮喘的炎症过程。FasL是Fas的天然配体，参与细胞凋亡信号转导。故研究TLR和FasL在淋巴细胞上的表达，对进一步探讨淋巴细胞在哮喘炎症机制中的作用有着深远意义。肿瘤坏死因子受体相关因子（tumornecrosisfactorreceptorassociated factor，TRAF）是TNF超家族成员之一，不仅能增强TNFR诱导的炎症因子的产生，增强TNFR1-TNFR2的协同作用［2］，还与炎症细胞的分化有关［3］，介导机体自然免疫和获得性免疫。最近发现，TRAF1还与Th1/Th2平衡有关，它能抑制Th2炎性反应［4］。但TRAF2在哮喘发病机制中的作用如何，目前知之甚少。本研究通过观察哮喘大鼠TLR1、FasL和TRAF2的表达及甲基强的松龙对其影响，探讨其在哮喘发病中的可能作用机制，为哮喘的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 鸡卵白蛋白（OVA）Ⅴ级购自美国Sigma公司，小鼠抗大鼠TRAF2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗大鼠TLR1-FITC和FasL-FITC抗体均购自上海研吉生物科技有限公司。即用型SP系列检测试剂盒（其中试剂B：生物素标记二抗工作液选用SP-9000）及DAB显色剂（ZLI-9018）均购自北京中山生物有限公司。

1.2 实验动物及分组 清洁级健康雄性SD大鼠27只，4～5周龄，体质量（121±7）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供［许可证号：SCXK（沪）2007-0005］，在杭州师范大学实验动物中心清洁级环境中饲养，室温20～25℃，湿度40%～60%，自主饮水、进食。随机分成哮喘组、正常对照组、甲基强的松龙组，每组9只。

1.3 动物模型复制［5］第1天和第8天腹腔注射OVA/Al（OH）3混合液2mL［含OVA 1mg和Al（OH）3100mg］致敏，各1次。第15天开始每天向大鼠喷雾（空气压缩雾化器：PARI BOY-037G6000 GERMANY）1%OVA 30min，连续激发7天。表现为烦躁不安、搔痒、喘鸣、腹肌抽搐等症状。对照组致敏和激发均以生理盐水替代OVA和Al（OH）3。甲基强的松龙组处理基本同哮喘组，但在每次抗原激发前30min给予腹腔注射甲基强的松龙4mg/只（辉瑞公司生产，批号X02247）。

1.4 血和肺组织标本制备 末次激发24h后，10%水合氯醛（400mg/kg）大鼠腹腔注射麻醉，心脏抽血1mL（EDTA抗凝）待检TLR1和FasL。取右内侧带肺组织，4%多聚甲醛-PBS溶液固定，常规石蜡包埋、切片，采用免疫组化SP法测定TRAF2的表达。

1.5 血淋巴细胞TLR1、FasL的表达 采用流式细胞术检测，操作步骤：分别取EDTA抗凝全血100μL，加入2个试管，各自分别加入10μL TLR1-FITC 或10μL FasL-FITC、室温下避光孵育20min，加入红细胞裂解液1mL，室温避光放置15～20min，振荡混匀，1500r/min离心5min，弃上清，用2mL PBS洗涤1次，加入400μL PBS重新浮悬细胞，上流式细胞仪检测。流式细胞仪测定:流式细胞仪经常规校正，FLOW CHECK cv值＜2，根据前向散射光（FS）和侧向散射光（SS）以淋巴细胞群设门，分别测定TLR1-FITC和FasL-FITC占的平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）。并收集10 000个细胞，同时设阴性对照。

1.6 免疫组化结果判定 光镜下观察细胞着色情况，蛋白定位于细胞胞浆内，阳性细胞胞浆呈棕黄色表达，结构清晰，着色明显高于背景。每张切片随机选择5个细支气管，Image-pro Plus 5.1免疫组化图像分析系统对阳性细胞进行灰度扫描，取其平均值代表该片的光密度值（OD值）。

2 结 果

2.1 各组血淋巴细胞TLR1表达 哮喘组血淋巴细胞TLR1表达水平显著低于甲基强的松龙组（P＜0.05），正常对照组血淋巴细胞TLR1表达水平与哮喘组及甲基强的松龙组比较，差异无统计学意义（均P＞0.05），见表1、图1。

表1 各组血淋巴细胞TLR1和FasL表达水平（±s）

表1 各组血淋巴细胞TLR1和FasL表达水平（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与哮喘组比较，△P＜0.05

n/只TLR1（MFI）FasL（MFI）组 别8 8 7 49.23±4.06 47.58±1.46 52.89±3.92△11.73±1.39 15.52±0.53*14.46±2.19*正常对照组哮喘组甲基强的松龙组

2.2 血淋巴细胞FasL表达水平 哮喘组和甲基强的松龙组血淋巴细胞FasL表达水平均显著高于正常对照组（P均＜0.05），而哮喘组血淋巴细胞FasL表达水平与甲基强的松龙组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1、图2。

2.3 肺组织TRAF2表达 免疫组化结果显示，阳性细胞的胞浆呈棕黄色表达，主要表达于气道上皮细胞和炎症细胞等，而肺组织中却较少表达。哮喘组TRAF2光密度值显著高于对照组和甲基强的松龙组（P均＜0.01），甲基强的松龙组TRAF2光密度值与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表2、图3。

表2 各组肺组织TRAF2表达水平（±s）

表2 各组肺组织TRAF2表达水平（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与哮喘组比较，△P＜0.01

n/只9 9 8 TRAF2（OD值）0.220±0.057 0.317±0.041*0.235±0.028△组 别对照组哮喘组甲基强的松龙组

图1 流式细胞术显示血淋巴细胞TLR1的散点图

图2 流式细胞术显示血淋巴细胞FasL的散点图

3 讨论

哮喘的病因和发病机制一直是研究的热点，TLR是新近发现的先天性免疫的病原模式识别受体，识别自身和异体抗原，介导多种免疫细胞，激活炎症因子，调节炎症反应［6］。TLR在慢性炎症的发生和发展中起重要作用，它介导的炎症因子、细胞因子可导致哮喘气道重塑［7］。在哮喘发病的“卫生假说”机制中起着重要的作用，不管是先前的“卫生假说”和新的“卫生假说”，都认为环境因素通过TLR影响着哮喘的发病。本研究发现，哮喘组血淋巴细胞TLR1的表达水平与对照组相近，提示TLR1可能不需要通过OVA诱导途经激发；而甲基强的松龙能显著提升TLR1的表达水平，提示甲基强的松龙的抗炎作用可能部分通过上调TLR1起作用。相似的研究也发现，OVA诱导的哮喘大鼠模型中，TLR4在哮喘组和对照组中无差别，而地塞米松可提升TLR4的表达［8］，支持糖皮质激素可能通过TLR起到抗炎的作用的论点。

图3 肺组织TRAF2的表达，阳性细胞的胞浆呈棕黄色表达，主要表达于气道上皮细胞等（SP×200）

FasL属于肿瘤坏死因子/神经生长因子超家族成员，在体内主要以膜结合形式存在，是一种Ⅱ型跨膜蛋白。FasL与细胞表面的Fas结合，可诱导表达Fas的靶细胞凋亡［9］。淋巴细胞通过此途径，杀伤表达Fas的靶细胞。正常的Fas系统能有效地去除过度激活的免疫活性细胞，从而下调免疫反应及细胞毒性淋巴细胞的功能。在病理状态下，可影响Fas的表达，使细胞凋亡过程发生改变。本研究结果显示，哮喘组血淋巴细胞FasL表达水平高于对照组（P＜0.05），可能与哮喘患儿血淋巴细胞Fas表达下降引起FasL反应性升高有关［10］。甲基强的松龙不能下调FasL表达水平，提示它不是通过抑制FasL表达而发挥抗炎作用，但是否存在量效关系尚有待于进一步研究。

TRAF2是TRAF家族的表达最为广泛的TRAF家族成员，几乎在所有组织中转录，能与TNFR家族中的大多数成员相互作用。TRAF2可以直接与TNF家族中的一些不含死亡结构域的成员连接，也可以与细胞内蛋白，包括MAP3K家族的蛋白酶、激活NF-κB调控因子、抗凋亡因子等相互作用，参与TNF-R1介导的NF-κB和JNK的激活过程，诱导基因表达，对多种生理过程十分重要，如细胞生长、死亡、发育、癌基因的表达、免疫和感染等［11］。本研究发现，TRAF2主要表达于气道上皮细胞和炎症细胞中，而支气管平滑肌中却较少表达，提示它可能主要是通过气道上皮细胞和炎症细胞起作用。TRAF1的表达部位却与之不同，它主要表达在支气管平滑肌细胞，可能通过支气管平滑肌细胞的途经参与哮喘气道高反应性［12］。本研究还发现，哮喘大鼠肺组织TRAF2表达水平显著高于对照组（P＜0.01），提示TRAF2可能与哮喘的气道炎症有关。相似的研究也发现，在OVA诱导的哮喘小鼠模型中发现，支气管肺泡灌洗液中炎症细胞（嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）、Th2细胞因子和气道高反应性显著性增加，而TRAF1缺失的小鼠则无上述改变，认为TRAF1可能是促进哮喘炎症的一个细胞因子［13］。上述表明，TRAF家族在哮喘的发病中可能起到致炎作用，抑制或阻断TRAF信号通路可能是治疗哮喘另一个有效的途经。甲基强的松龙组TRAF2表达水平显著下降，且与对照组相近，提示甲基强的松龙能有效地抑制TRAF2表达，且能达到正常的生理水平，其减轻气道炎症可能部分通过TRAF2途经实现。

以上结果显示，哮喘组大鼠FasL和TRAF2表达增加，它们可能参与了哮喘的炎症机制；TLR1无变化，可能它不是通过OVA诱导途经；甲基强的松龙能下调TRAF2和提升TLR1水平，从而起到抗炎的作用，但对FasL无影响。淋巴细胞可能通过FasL和TLR1参与哮喘炎病机制，此过程受甲基强的松龙调节。

［1］中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南［J］.中华结核和呼吸杂志，2008，31（3）:177-185.

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Regulation with Methylprednisolone on the Expression of Toll like receptor 1,FasL,and Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor 2 in Asthmatic Rats

JIANG Defu,TONG Xiasheng,LUO Dongjiao,et al.The Second People’s Hospital of Wenling,Taizhou(317500),China

Objective：To investigate the potential effects of methylprednisolone on the expression of Toll like receptor 1(TLR1),FasL,and tumor necrosis factor receptor associated factor 2(TRAF2)in asthmatic rats.Methods:Twenty-seven SD rats were randomly divided into 3 groups,including asthma group,control group,and methylprednisolone-treated group.The levels of TLR1 and FasL in blood lymphocyte were detected by flow cytometry.The expression of TRAF2 protein was detected by immunohistochemical methods.Results:The level of TLR1 in the asthma group（47.58±1.46 ）MFI was significantly lower than that in the methylprednisolone-treated group（52.89±3.92 ）MFI(P＜0.05);The level of TLR1 in the control group did not differ to that in the asthma group or the methylprednisolone-treated group（all P＞0.05）.The level of FasL in the asthma group（15.52±0.53 MFI）and the methylprednisolone-treated group（14.46±2.19 MFI） were both significantly higher than that in the control group（11.73±1.39 MFI）(all P＜0.05),but no significant difference was noted between the asthma group and the methylprednisolone-treated group(P＞0.05).The expression of TRAF2 protein in the asthma group(0.317±0.041 optical density)was dramatically higher than that in the control group（0.220±0.057 optical density）and the methylprednisolone treated group(0.235±0.028 optical density)（all P＜0.01）,but no significant difference was seen between the methylprednisolone-treated group and the control group（P＞0.05）.Conclusion:The levels of FasL and TRAF2 were elevated and TLR1 had no change in asthmatic rats.The anti-inflammation role of methylprednisolone may be partly through down-regulating TRAF2 and up-regulating TLR1,but had no effect on FasL.

rats asthma Toll like receptor FasL tumor necrosis factor receptor associated factor glucocorticoids

浙江省医药卫生科技计划项目（No.2007-B238），浙江省温岭市科技局基金资助项目（No.2009-2-55）

通迅作者：童夏生，E-mail:xshtzg@163.com

2012-01-13