李晓斐

(青岛市传染病医院检验科 山东 青岛 266033)

乙型肝炎是一种高发传染病，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染后有5% ～10%的患者将发展为慢性肝炎(chronic hepatitis，CH)，而这又是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发生的高危险因素(几率比正常人大100倍)[1-2]。HBV基因具有4个开放式阅读框架(open reading frame，ORF)，其中X基因是最小的开放式阅读框架，位于第1374～1835位核苷酸之间，全长462bp，编码154个氨基酸，为相对分子质量17000的X蛋白。目前认为HBx是一种多效转录激活因子，其本身不能与双链DNA直接结合，而是通过蛋白与蛋白之间的相互作用来行使功能。HBx基因是HBV复制和扩散所必需的基因，在乙肝慢性化和HCC的发生中具有重要作用[3-4]。

为了进一步研究X基因的生物学特性及其与HCC发生的关系，我们构建了HBV X基因的真核表达载体，并在真核细胞中进行表达。

材料和方法

一、材料

乙型肝炎患者血清采自青岛市传染病医院门诊及住院患者。DH5α由青岛市传染病医院检验科保存，HepG2细胞由青岛大学微生物实验室惠赠;pcDNA6(+)质粒购自Invitrogen公司;多聚乙烯酰胺(PEI)购自Sigma公司;dNTP、Taq酶、T4连接酶、EcoRⅠ、HindⅢ、100 bp DNA Marker购自上海生物工程公司;鼠抗人HBV X一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购于晶美生物工程公司;Western Blot试剂盒购自 RPL公司;RPMI 1640和胎牛血清购自Gibco公司;引物由上海生物工程公司合成提供。

二、方法

1.真核表达载体pCDNA6(+)-HBx的构建

(1)血清HBV DNA提取:100 μL血清加入300 μL TES液混匀，60℃消化1 h，等体积苯酚/氯仿及氯仿抽提各1次，上清加入2倍体积无水乙醇及1/10体积3 mol/L醋酸钠(pH值4.8)沉淀病毒DNA，再以70%乙醇漂洗1次，并溶于20μL灭菌双蒸水中;(2)PCR扩增X基因:引物设计，扩增X基因片段。……