韩文莲 宋金玲

湖北省襄阳市食品药品检验所，湖北襄阳 441021

红花注射液为活血化瘀、消肿止痛药，主要用于治疗闭塞性脑血管疾病、冠心病、心肌梗死、脉管炎；对高脂血症、糖尿病并发症、月经不调、类风湿关节炎等有辅助治疗作用。临床多采用静脉滴注的方法给药。文献规定[1]：某些中药注射剂，由于含有溶血成分或物理、化学及生物等方面的原因，在直接注入血管后可产生溶血作用；也有些注射剂中因含有杂质等成分，注入血管后可产生血细胞凝聚，引起血液循环功能障碍等不良反应；另外，因中药制剂的成分复杂，也存在因免疫反应引起的免疫性溶血。因此凡是注射剂和可能引起免疫性溶血和非免疫性溶血反应的其他药物制剂均应进行溶血性试验。红花注射液虽已在临床应用，但其原质量标准中未设立溶血与凝聚检查项。本文通过对中药红花注射液溶血和凝聚试验的研究，为临床用药安全提供依据。

1 材料与方法

1.1 试药与仪器

红花注射液（规格：5 mL/支，十堰金鼎制药有限公司，批号：110401），80-1离心机（上海手术器械厂），紫外分光光度计UV-2012PC（尤尼柯上海仪器有限公司）。

1.2 动物

大耳白兔，体重3.0 kg供采血（湖北襄阳动物养殖中心）。

2 方法

2.1 2%红细胞混悬液的制备

家兔耳缘静脉取血，放入有玻璃珠和抗凝剂的三角瓶中振摇10 min除去纤维蛋白原，使成脱纤血液，加入0.9%氯化钠溶液约10倍量，摇匀，于离心机中1 500 r/min离心10 min，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9%氯化钠溶液按上述方法洗涤3次，至上清液不显红色为止[2]。将所得红细胞用0.9%氯化钠溶液配成2%的混悬液，备用，并于当天使用。

2.2 溶液制备

取红花注射液 0.1、0.3、0.5、0.8、1.1 mL，加到试管中平行做3只管，加入无菌0.9%氯化钠溶液补充总体积至2.5 mL，再依次加入2%的红细胞混悬液2.5 mL作为供试品管[3]。阴性对照管加入无菌0.9%氯化钠溶液2.5 mL和2%的红细胞混悬液，阳性对照管加入蒸馏水2.5 mL和2%的红细胞混悬液，再取4.7 mL 0.9%氯化钠溶液加0.3 mL的供试品作为供试品的对照管[1，4]。

2.3 肉眼观察

将试管放入（37±0.1）℃恒温箱中进行保温，开始每15分钟观察1次，1 h后，每隔1 h观察1次，3 h后取出试管，对阳性对照管、阴性对照管、每组供试品管及其供试品对照管进行肉眼观察。试管中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液无色澄明，或上清液虽有色澄明，各管肉眼观察无明显差异，则表明无溶血发生。若溶液中有棕红色或棕红色絮状沉淀，轻轻振摇仍不能分散，则表明有红细胞凝聚发生，应进一步置显微镜下观察[4]。

2.4 分光光度法

根据红细胞破裂释放出的血红素在575 nm波长处有最大吸收[5]，取各管的上清液置于比色管中，来测定红花注射液的溶血度。将在（37±0.1）℃恒温1 h后的各管取出，在1 500 r/min离心5 min，上清液取于比色管中，以阴性管作为空白，在575 nm处测得各管的吸光度[6]。

溶血度（%）=（A试验管-A阴性管）/（A阳性管-A阴性管）×100%。式中：A试验管为试验管吸光度，A阴性管为阴性对照管吸光度，A阳性管为阳性对照管吸光度。

3 结果

3.1 肉眼观察法测红花注射液溶血结果

通过与阴性对照管、阳性对照管、样品对照管各管之间的比较后，各管之间肉眼观察区别不大。结果见表1。

表1 肉眼观察法测红花注射液溶血结果

由表1可见，蒸馏水对照管（阳性对照管）因体系不等渗而致红细胞破裂发生溶血，形成红色澄明溶液，0.9%氯化钠溶液对照管（阴性对照管）与各被试管在观察的时间内均无溶血及红细胞凝集发生[7]。

3.2 分光光度法溶血测定结果

对本批红花注射液的溶血度用分光光度法测定的结果见表2。

表2 分光光度法溶血测定结果

4 讨论

《中国药典》[4]规定了采用肉眼观察法对中药注射液溶血进行观察，适用于溶血较明显的样品，但有些中药注射液本身的颜色和部分红细胞破裂后释放出的血红色素，对结果判断会产生影响。

《药物研究技术指导原则》[1]中指出溶血反应发生的机制复杂，目前尚无标准的临床前体内试验以全面评价药物制剂的溶血反应。实验时应注意观察溶血反应的有关指标及体征，如出现溶血时应进行进一步研究。还对分光光度法测定溶血试验的参考指标明确指出，当溶血率＞5%时，不宜用于静脉注射。根据红细胞破裂释放的血红素在575 nm有最大吸收的原理[5]，利用分光光度法进行溶血性试验操作时，应注意离心的速度及温度对试验结果的影响。可能有些药物分子及附加剂在离心时与红细胞发生碰撞的力量较大，若离心速度较快，易导致非药物溶血现象的出现。此外，因不同的中药注射剂颜色及深浅不同，若其色泽对血红素的最大吸收有干扰，则应注意排除非药物因素的影响[8]。因本品红花注射液为棕黄色的液体，特设一底色组，用样品的吸光度减去底色组的吸光度的差值，提高实验的准确度。在本实验中，红花注射液在恒温 （37±0.1）℃温育1 h后肉眼观察无明显溶血现象，在1 500 r/min离心5 min，取上清液于比色皿中，紫外分光光度法检测溶血度均小于5%，因此从溶血标准上认为本品可以作为静脉注射用。通过两种方法的比较认为采用分光光度法测定中药注射剂的溶血程度，具有操作简便、稳定性好、能消除常规试管观察法带来的主观误差等优点，对临床安全用药有重要的指导意义。

[1]国家食品药品监督管理局.药物研究技术指导原则（中药·天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则）[M].北京：中国医药科技出版社，2005：230.

[2]稽扬，王文俊，沈娟，等.注射用七叶皂苷钠的体外溶血与凝聚试验[J].中国药品标准，2008，4（9）：284-286.

[3]陈奇.中药药理研究方法学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2011.

[4]国家药典委员会.中国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录 92.

[5]张剑锋，项峥，窦德强.血塞通注射液溶血检测方法研究[J].中国现代中药，2011，1（13）：34-38.

[6]杨光，项峥，康延国，等.人参皂苷溶血测定的实验条件研究[J].辽宁中医药大学学报，2008，10（6）：190-191.

[7]王秋菊，吕娟，梁晨，等.注射用三磷酸胞苷二钠的溶血性、过敏性及血管刺激性研究[C].中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集，2008.

[8]章宝娟.中药注射剂溶血性试验方法的研究概述[J].海峡药学，2007，8（19）：79-81.