陈海楠，杨祖菁

（上海交通大学医学院附属新华医院妇科，上海200092）

p16、β-catenin、CyclinD1在宫颈病变中的表达及其临床意义

陈海楠，杨祖菁*

（上海交通大学医学院附属新华医院妇科，上海200092）

目的检测p16、β-catenin和CyclinD1在正常宫颈、宫颈上皮内瘤样病变（CIN）以及宫颈癌(CC)中的表达，研究其在宫颈病变发生发展过程中的作用及可能机制。方法应用免疫组化Envision System二步法检测p16、β-catenin和CyclinD1蛋白在正常宫颈组织(非恶性肿瘤原因切除)、CIN和CC中的表达情况，比较三种蛋白在三组间的表达强度，并进行相关性分析。结果p16、β-catenin和CyclinD1蛋白阳性表达在正常宫颈组织、宫颈上皮CIN和CC组三组中差异具有统计学意义（P=0.00，P=0.00，P=0.00）。在正常宫颈组中三种蛋白互相之间有相关性，且呈正相关性（P=0.00，P=0.000，P=0.02）；在CIN组中，p16和β-catenin、β-catenin和CyclinD1之间有相关性，且呈正相关性（P=0.03，P=0.00），p16和CyclinD1蛋白之间有一定的相关性，差异有统计学意义(P=0.42＜0.05)；在CC组中三种蛋白互相之间有相关性，且呈正相关性（P=0.01，P=0.01，P=0.01）。结论p16、β-catenin和CyclinD1蛋白在宫颈组织中异常表达可能与宫颈病变的发生和发展相关。

宫颈癌；宫颈上皮内瘤样病变；β-连接素；细胞周期蛋白D1；p16蛋白

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，每年其在全球的新发病例数约50万人，由于宫颈癌而导致死亡的人数达23万～29万[1]。目前宫颈癌确切的病因尚未完全明了，虽然高危型HPV感染被认为是它的主要病因[1]，但并非所有感染高危型HPV的患者都会发展为宫颈癌，这是由于人自身免疫机制的作用可以清除部分的病毒，且高危型HPV感染宫颈并导致宫颈癌的发生还需要其他因素的协同作用[2-3]。研究表明，宫颈癌的发生发展是多因素多阶段演变的结果，有多种癌基因和抑癌基因的参与[2]。

随着分子生物学技术的发展和研究的深入，人们逐渐认识到细胞周期调节紊乱可能是肿瘤发生的重要环节。因此，有关细胞周期调控的相关蛋白、调控的机制与肿瘤的发生的关系、细胞信号的转导、相关的细胞周期检测点逐渐成为学界研究的热点问题。p16、β-catenin和CyclinD1蛋白作为细胞周期调节蛋白，主要作用于G1期，发挥调节作用。近年来三者在宫颈病变中的单独作用研究较多，本文主要通过检测p16、β-catenin和CyclinD1在正常宫颈、CIN以及宫颈癌中的表达，探讨其在宫颈肿瘤的发生发展过程中的作用及可能机制。

1 资料与方法

1.1 标本来源选取交通大学医学院附属新华医院2011年8月至2012年1月初诊、未治宫颈癌21例；CIN 24例；正常宫颈组织22例作为对照。CIN组和宫颈癌组的标本取自术后病变宫颈组织，正常宫颈组织则来源于因非恶性肿瘤原因（如子宫肌瘤、子宫肌腺症等）行全子宫切除的手术的宫颈组织，全部病例组织经病理科两位医师诊断确诊。诊断标准符合宫颈癌和宫颈上皮内瘤样病变的病理诊断标准[4]。

1.2 方法所有标本经10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm厚度切片，常规HE染色和免疫组化染色（采用S-P法）鼠抗人单克隆抗体p16、鼠抗人单克隆抗体cyclinD1、鼠抗人单克隆抗体β-catenin购自上海长岛生物技术有限公司。严格按说明书操作，DAB显色。以已知蛋白表达阳性的组织作为阳性对照。用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定标准p16阳性部位为细胞核/细胞浆，β-catenin阳性部位为细胞浆/细胞核，Cyclin D1阳性部位为细胞核。免疫组化染色阳性反应为黄-棕黄颗粒。按许良中等[5]的研究，对染色结果采用双评分法进行判定，根据阳性细胞的比例和显色强度两方面决定。记分标准：阳性细胞数＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；显色强度评分：不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两者乘积≤1为阴性，1～3为弱阳性，＞3为阳性。

1.4 统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行数据处理。三种蛋白在各组的表达结果的比较采用两等级资料比较的Mann-Whitney U秩和检验；三种蛋白在各组中的两两相关性采用Spearman等级相关分析进行统计分析。以α=0.05为检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p16在正常宫颈组织、CIN和宫颈癌细胞中的表达三组中p16的阳性率分别为9.09%(2/22)、83.33%(20/24)、95.24%(20/21)。阳性表达主要集中于细胞浆（图1、图2）。各组间表达差异有统计学意义（P＜0.01)，见表1。

表1 p16、β-catenin和CyclinD1蛋白在正常宫颈组织、CIN、宫颈癌三组中的表达(例)

图1 CIN中p16的阳性表达(×200)图2宫颈癌中p16的阳性表达(×200)

2.2 β-catenin在正常宫颈组织、CIN和宫颈癌细胞中的表达三组中β-catenin的阳性率分别为18.18%(4/22)、54.17%(13/24)、71.43%(15/21)。CIN组阳性表达主要集中于细胞浆（图3），宫颈癌组阳性表达更多见于细胞核（图4）。各组间表达差异有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

2.3 CyclinD1在正常宫颈组织、CIN和宫颈癌细胞中的表达三组中CyclinD1的阳性率分别为13.64%(3/22)、41.67%(10/24)、80.95%(17/21)。阳性表达主要集中于细胞核（图5、图6）。各组间表达差异有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

图3 CIN中β-catenin的阳性表达(×200)图4宫颈癌中β-catenin的阳性表达(×200)

图5 CIN中Cyclin D1的阳性表达(×200)图6宫颈癌中Cyclin D1的阳性表达(×200)

2.4 p16、β-catenin和CyclinD1蛋白在CIN、宫颈癌三组中表达的相关性使用Spearman等级相关分析法分析CIN组中p16和β-cetenin的表达有正相关性，差异有统计学意义（r=0.440，P＜0.05）。CIN组中β-cetenin和Cyclin Dl的表达有正相关性，差异有统计学意义（r=0.625，P＜0.01）。CIN组中Cyclin Dl和p16的表达无相关性(r=0.172，P＞0.05）；宫颈癌组中p16和β-cetenin的表达有正相关性，差异有统计学意义（r=0.568，P＜0.01）。宫颈癌组中β-cetenin和Cyclin Dl的表达有正相关性，差异有统计学意义(r=0.580，P＜0.01)。宫颈癌组中Cyclin Dl和p16的表达有正相关性，差异有统计学意义（r=0.685，P=0.01）。

3 讨论

细胞生长周期为G1期-S期-G2期-M期。在此细胞周期中，G1期到S期、G2期到M期被认为是关键点。由于G1期为控制细胞周期长短的限速期[6]，且终末分化的细胞也停留于此期，所以G1期到S期对细胞的增殖更为重要。部分细胞周期调节蛋白正是通过促进或抑制细胞通过G1期来调控细胞的增殖和分化。

β-cetenin作为一种多功能的蛋白，广泛存在于各种类型的细胞。一方面通过与细胞膜上的钙黏蛋白相互作用，参与细胞的粘附；另一方面作为wnt信号通路中的关键调控因子，参与细胞的增殖、分化和凋亡等重要的调节作用[7]。在有wnt信号时，wnt配体与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP受体)和卷曲蛋白(Fz受体)及胞质内的蓬乱蛋白(DV1)结合后，在轴蛋白Axin的协助下，使β-catenin多聚复合体糖原合酶激酶3β（GSK-3β）的活性受抑制，从而避免β-catenin的降解，使得β-catenin在细胞浆中积累，并进入细胞核，与转录因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)结合形成二聚体，激活下游靶基因Cyclin D1等的转录，引起细胞增殖和分化失控导致肿瘤发生[8]。Rodríguez-Sastre等[9]将正常组织与43例癌前病变组织，126例浸润型癌进行了免疫组化分析比较，62%癌前病变组织及70%以上的癌组织胞浆中有β-catenin的异常分布，同时在40%的癌变前组织中β-catenin胞膜表达均缺失，说明β-catenin蛋白异常表达与宫颈癌的发生具有密切关系。本研究同样显示β-catenin在CIN组和CC组存在较高的易位表达率，阳性率分别达到54.17%和71.43%，这可能与wnt信号转导相关，当wnt信号不存在时，β-catenin可与细胞膜上的钙黏蛋白结合，在胞浆内则被有效的降解，所以在正常宫颈组织中多为正常表达；当存在wnt信号时，β-catenin不易被降解，进一步向细胞浆和细胞核内聚集，表现为易位表达，说明其易位表达与宫颈病变的进展密切相关。

Cyclin D1作为G1期细胞周期素，以及wnt/ β-catenin信号通路调控的靶蛋白，在G1/S期转换中起重要作用。在生理状态下，细胞进入S期后CyclinD1迅速分解。如CyclinD1基因激活，则CyclinD1持续高表达，将导致G1期缩短，提前进人S期，继而导致遗传基因突变和染色体结构异常的细胞获得增殖，使细胞增殖失控，最终形成肿瘤[10-11]。古丽娜·库尔班等[12]检测了正常宫颈、CIN及宫颈癌组织中的CyclinD1的表达，显示随宫颈病变的进展，表达强度逐级提高，证实CyclinD1的过度表达与宫颈癌的发生发展有关。本研究也提示，CyclinD1在正常宫颈组织中呈低表达，在CIN组和宫颈癌组中表达逐渐上升，且和正常组织比较差异有统计学意义。推测其可使宫颈细胞调控发生紊乱，导致细胞增生异常，对宫颈病变的发生和发展起推动作用。

本研究对wnt/β-catenin信号通路及其下游受控靶蛋白之一的CyclinD1的相关性研究显示，两者存在显著的正相关性，提示wnt/β-catenin信号通路在宫颈病变的发展中起着重要作用。

编码p16蛋白的p16基因被视为抑癌基因，在肿瘤组织中发生缺失、突变及甲基化，抑癌基因的失活也被认为在宫颈癌的发生中起重要作用。p16基因启动子的甲基化是常见的失活形式[13]。由于p16蛋白在CyclinD-CDK4/6-pRb-E2F调节途径中和CyclinD1竞争CDK4/6，且具负反馈调节作用，故而高磷酸化的pRb增多可以导致p16蛋白的高表达。Benevolo等[14]报道，使用免疫组化检测了100例宫颈组织，提示随宫颈病变的加剧，p16蛋白阳性率逐渐升高。Nam等[15]的研究也证实，在从CIN到宫颈癌的病变过程中，p16阳性率呈上升趋势，差异有统计学意义。本研究也得到了同样的结论，即p16阳性率随宫颈病变的加重，呈上升趋势，且差异有统计学意义。而相关性研究显示，在CIN组中，p16和CyclinD1的相关性不明确，而在宫颈癌组中，两者的相关性有统计学意义，也提示，随着宫颈病变的加重，CyclinD1的阳性率进一步上升，使得高磷酸化的pRb增多，负反馈导致p16阳性率也发生明显增加。

综上所述，宫颈癌的发病机制复杂，绝不是单一因素导致的结局，而是一个多阶段、多基因、多因素共同参与的结果。正是由于宫颈病变是个多因的、渐进的过程，这也给早期诊断和早期治疗提供了更多的途径和机会。对宫颈组织进行p16、β-catenin和CyclinD1蛋白的检测，有助于对宫颈病变的早期诊断，同时也为宫颈癌的治疗提供一种新的方向。对研究对象进行系统的随访研究，可进一步探讨三种调节蛋白对宫颈病变预后的相关性。

[1]Abdelmutti N,Hoffman-Goetz L.Risk messages about HPV.cervi-cal cancer,and the HPV vaccine gardasil in North American News Magazines[J].J Cancer Educ,2010,25(3)：451-456．

[2]Almonte M,Albero G,Molano M,et al.Risk factors for human papillomavirus exposure and co-factors for cervical cancer in Latin America and the Caribbean[J].Vaccine,2008,19(26)：16-36.

[3]Einstein MH,Studentsov YY,Ho GY,et al.Combined human papillomavirus DNA and human papillomavirus-like particle serologic assay to identify women at risk for high-grade cervical intraepithelial neoplasia[J].Int J Cancer,2007,120(1)：55-59.

[4]刘彤华.诊断病理学[M].2版.北京：人民卫生出版社,2006：408-414.

[5]许良中,杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准[J].中国癌症杂志,1996,6(4)：229-231.

[6]Hichman KA,Roberts JM.Rules to Replicat by[J].Cell,1994,79：557-562．

[7]Ewan KB,Dale TC.The potential for targeting oncogenic WNT/beta-catenin signaling intherapy[J].Curr Drug Targets,2008,9(7)：532-547.

[8]Loeppen S,Koehle C,Buchmann A,et al.A beta-catenin-dependent pathway regulates expression of cytochrome p450 isoforms in mouse liver tumors[J].Carcinogenesis,2005,26(1)：239-248.

[9]Rodríguez-Sastre MA,González-Maya L,Delgado R,et al.Abnormal distribution of E-cadherin and beta-catenin in different histologic types of cancer of the uterine cervix[J].Gynecol Oncol,2005, 97(2)：330-336.

[10]Udhayakumar G,Jayanthi V,Devaraj N,et a1.Interaction of MUC1 with beta-catenin modulates the Wnt target gene cyclinD1 in H.pylori-induced gastric cancer[J].Mol Carcinog,2007,46(9)：807-817．

[11]Motokura T,Bloom T,Kim HG,et al.A novel Cyclin encoded by a bell-linked candidate oncogene[J].Nature,1991,350(6318)：462-463.

[12]古丽娜·库尔班,李小文,赵峰,等.β-catenin、Cyclin D1和c-myc在CIN及宫颈鳞癌中的表达及意义[J].新疆医科大学学报, 2008,31(6)：641-644.

[13]Redman R,Rufforny I,Liu C,et al.The utility of p16(Ink4a)in discriminating between cervical intraepithelial neoplasia 1 and nonneoplastic equivocal lesions of the cervix[J].Arch Pathol Lab Med, 2008,132(5)：795-799.

[14]Benevolo M,Mottolese M,Marandino F,et a1.Immunohistochemical expression of p16(INK4a)is predictive of HR-HPV infection in cervical low-grade lesions[J].Mod Pathol,2006,19(3)：384-391.

[15]Nam EJ,Kim JW,Kim SW,et a1.The expressions of the Rb pathway in cervical intraepithelial neoplasia；predictive and prognostic significance[J].Gynecol Oncol,2007,104(1)：207-211.

Expression of p16,β-catenin,CyclinD1 in cervical lesions and their clinical significance.

CHEN Hai-nan,YANG Zu-jing*.Department of Gynecology,Xinhua Hospital Affiliated to School of Medicine of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200092,CHINA

ObjectiveTo study the role of p16,β-catenin,CyclinD1 in the pathogenesis and development of cervical disease,by investigating their expression in normal cervical tissue,cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and cervical carcinoma(CC).MethodsThe expression of p16,β-catenin and cyclinD1 was tested by SPimmunohistochemistry in normal cervical tissue,CIN and CC.ResultsThe positive expression rates of p16,β-catenin and CyclinD1 showed statistically significant difference between normal cervical tissue,CIN and CC(P=0.00,P=0.00,P=0.00＜0.05). In normal cervical tissue,the expression of p16,β-catenin and CyclinD1 was positively correlated(P=0.00,P=0.00, P=0.02＜0.05).In CIN,the expression between p16 and β-catenin as well as that between β-catenin and CyclinD1 was positively correlated(P=0.03＜0.05,P=0.00＜0.05),while no significant correlation was found between p16 and CyclinD1(P=0.42＞0.05).In CC,the expression of p16,β-catenin and CyclinD1 was positively correlated(P=0.01, P=0.01,P=0.01＜0.05).ConclusionThe abnormal expression of β-catenin,p16 and CyclinD1 may be associated with the occurrence and development of cervical lesions.

Cervical cancer;CIN;β-catenin;CyclinD1;p16 protein

R711.74

A

1003—6350（2012）22—014—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.22.005

2012-04-18）

陈海楠（1978—），男，上海市人，主治医师，在读硕士，研究方向：宫颈恶性肿瘤及内分泌。

*通讯作者：杨祖菁。E-mail:yzujing@sohu.com