阎红娥,王 宽,鲍文华,李新苗,刘忠鑫,王桂丽

(佳木斯大学附属第一医院呼吸内科,黑龙江 佳木斯 154003)

恶性肿瘤的发生不仅与细胞凋亡调节紊乱所导致的细胞凋亡受抑制有关、而且与肿瘤的分化及肿瘤细胞的异常增殖有关 ,凋亡因子的抑制、凋亡通路的紊乱、凋亡基因的表达失控、凋亡因子的过表达都会导致肿瘤的发生和发展,成为恶性肿瘤形成的重要机制之一。HMG蛋白是一中高迁移率蛋白[1](high mobility group protein),是由 1973年由英国学者 Goodwin等[2]在牛胸腺细胞中第一次发现的,该蛋白家族的名字出自于其在聚丙烯酞胺凝胶中的高迁移率。较为广泛的定义中 HMG家族蛋白质中包括比较经典 HMG蛋白和

HMG模体(moti幻基序蛋白两大类蛋白质。HM GN家族中包括 HMGN1、HMGN2和 HM GN4等等多个蛋白。近年来也发现了一些如 HM GN3和 HM GN5(N SBP1)具有组织特异性的 HM GN蛋白,HM GN在哺乳动物和多数脊椎动物的细胞核中广泛表达[3]。HMGN5即 N SBP1,是 HM GN家族中的一员,在细胞浆内定位、分布与细胞周期和细胞的新陈代谢有关。HMGN5能够促使细胞从 G1期进入 S期,从而导致细胞分裂加速,也参与了肺癌细胞克隆、增殖能力形成,提示

HMGN5基因参与了肺癌发生和发展过程,使 HMGN5成为肺癌基因治疗的新靶点,并为治疗肺癌提供新的理论研究基础和思路。Twist通常情况下主要表达于胚胎中胚层、胎盘和成人的某些中胚层来源的未分化组织[4],是一种存在于果蝇、鼠和人等生物体内的碱性螺旋-环-螺旋转录调节因子。近期有关实验报道 Twist表达增高 ,如乳腺癌[5]、前列腺癌[6]、胃癌[7]在多种人类上皮来源肿瘤中发现,这说明可能与 Twist能介导上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)有关。本文旨在运用免疫组化方法测定非小细胞肺癌(NSCLC)组织中 HMGN5、Twist的表达及在肺癌发生和发展中的作用及其相互之间的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源

随机选取佳木斯大学附属第一医院2010-12～ 2011-12手术切除 NSCLC组织标本 60例,Ⅰ 和Ⅱ 期共32例,III期28例均为原发性支气管肺癌,且术前未接受放化疗,取30例癌旁癌旁肺组织作为对照。

1.2 试剂

HM GN5抗体、Twist抗体、SP二抗试剂盒、DAB显色试剂盒,以上试剂均购于(天津索罗门生物有限公司)。

1.3 实验方法

(1)取佳木斯大学附属第一医院病理实验室确定为非小细胞肺癌石蜡标本60例,所有患者在术前未经放、化疗。取30例癌旁癌旁肺组织作为对照。(2)组织切片的准备,在轮转式切片机上作 4 μm的连续切片。(3)应用免疫组化 SP法检测 HM GN5在肺癌中的表达。将肺癌石蜡包埋组织做 4 μm厚切片,常规脱蜡、水化,行抗原修复 ,血清封闭,与 Twist抗体分别进行免疫组化染色。DAB显色,苏木精复染后脱水、透明、封片,光镜下观察。同时用已知的阳性切片在同条件下染色作为阳性对照,方法参照产品说明。

1.4 结果判断标准

HM GN5与 Twist均以肿瘤细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性,在400倍光镜下取5个不同视野各计数 200个癌细胞 ,阳性细胞数 ＜10%为阴性,10%～50%为弱阳性,＞50%为强阳性。每次实验均设置阳性和阴性对照,严格按 SP试剂盒的说明进行染色。

1.5 统计学处理

应用 SSPS17.0软件包进行数据分析,用i2检验及 t检验,以P ＜0.05为有统计学意义。

表1 N SCLC组织中 HM GN5、TW IST在各分组组织中的表达

2 结果

N SCLC组织中 HMGN5、TW IST的表达结果:HM GN-5、TW IST癌旁肺组织阳性率均为 16.7%(5/30),60例NSCLC组织中,HM GN5、Twist蛋白阳性表达率分别为65.0%(39/60)、71.7%(34/60),在 HM GN5、 TWIST早期 (I期、II期)N SCLC中阳性表达分别为 53.1%、65.6%(21/32)在 III期中晚期 NSCLC中阳性表达分别为 67.9%(19/28)、78.6%(22/28)如图1表示。在细胞浆内 HMGN的定位、分布与细胞的新陈代谢和细胞周期有关,(如图 A示 )、Twist阳性表达主要定位于细胞胞浆 ,为棕黄色颗粒,(如图 B示)。

图1 免疫组化检测 NSCLC组织中 HMGN5、Twist在各分组组织中的表达HMGN5(图 A)TWIST(图 B)

3 讨论

3.1 HM GN5在本次实验中的表达和意义

HM GN5,即核小体结合蛋白 l基因,是 King等人[8]于2001年从 BMSC的 cDN A文库中发现的新基因,最近有关研究表明 HMG因参与肿瘤的转移与浸润,表明在肿瘤的发生及发展中起到非常重要的作用,有研究报道结果表明抑制HMGN5的表达后可以抑制前列腺癌细胞的生长,而在HMGN5膀肤癌、前列腺癌中表达增高,提示 HMGN5可能导致肿瘤发生、发展。然而,目前尚未见 HM GN5在肺癌组织中的表达与病理相关性的研究报道,有关 HM GN5基因在肺癌发生、发展过程中的功能作用,至今尚不是很清楚。此次实验显示,HM GN5随着肿瘤的发生和发展过程逐渐高表达状态,中晚期高于早期,差异有统计学意义 (P＜0.05),表明HMGN5在 NSCLC发病后的预后判断有很大意义。

3.2 Twist在本次实验中的表达和意义

人的 Twist基因是一种位于7p21.2,这种蛋白质的编码是由202个氨基酸组成。Twist它在胚胎生长发育阶段诱导细胞迁移过程中起重要的调控作用[7]。并广泛表达于中胚层起源的组织细胞,但在出生后降至极底水平[9],Twist属于具有碱性螺旋 -环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)结构的转录因子家族成员。近期有关研究报道证实 Twist也参与了某些上皮来源的肿瘤细胞发生上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)并促进其侵袭转移。有关研究证明 Twist该基因几乎参与了整个细胞恶变的过程,Twist是一个能够促进多种人类恶性肿瘤形成和发展的非常重要的新基因。本次试验显示,N SCLC组织中 Twist阳性表达为 43例(71.7%),癌旁肺组织阳性表达为 5例(16.7%),差异有统计学意义 (P＜0.05)。并且本试验中早期 NSCLC组织 (I和 II期 )中低于中晚期 (III期 ),以上表明 Twist在NSCLC的发生发展中起到了重要因素,并为 NSCLC的早期诊断和预后判断提供了依据。

3.3 HM GN5与 Twist在 N SCLC组织中的表达意义

本次试验结果读片表明 HM GN5与 Twist在癌组织及癌旁正常组织的比较、早期和中晚期 NSCLC比较结果(P ＜0.05)。有关试验研究也表明 HM GN5能促进转录因子Twist的高表达。在 NSCLC组织中 HMGN5和 Twist主要在细胞内表达,两者随着 NSCLC加重并出现逐渐高表达水平。HM GN5与 Twist在在 NSCLC组织中表达成正相关 ,两者成协同作用。本次研究为 NSCLC的发生发展和治疗及手术后的预后生存期的判断起到至关重要作用。但两者的协同作用关系机制非常复杂,需有待研究人员进一步探讨研究,同时也将必定为 N SCLC的发生和发展及治疗和预后的判断提供非常好的依据。

[l]肖湘文,周建林,周畅.高迁移率族蛋白 [J].细胞生物学杂志,2006,28:501-506

[2]Goodwin GH,Sanders C,Johns EW.A new group of chromatinassociated proteinswith a high content of acidic and basic amino acids[J].Eur J Biochem,1973,38(1):14-19

[3]Bustin M.Chromatin unfolding and activ ation by HM GN(3)chromosomal proteins[J].Trends Biochem Sci,2001,26(7):431-437

[4]Kang Y,Massague J.Epithelialmesenchymal transitions:twist in dev elopment and metastasis[J].Cell,2004,118(3):277-279

[5]Watanabe O,Imamura H,Shimizu T,et al.Expression of twist and wnt in human breast cancer[J].Anticancer Res,2004,24(6):3851-3856

[6]Kwok WK,Ling M T,Lee TW,et al.Up-regulation of TWIST in prostate cancer and its implication as a therapeutic target[J].Cancer Res,2005,65(12):5153-5162

[7]Rosivatz E,Becker I,Specht K,et al.Differentialexpression of the epithelial-mesenchymal transition regulators snail,SIP1,and twist in gastric cancer[J].Am J Pathol,2002,161(5):1881-1891

[8]King LM,Francomano CA.Characterization of a human gene encoding nucleosomal binding protein NSBP1[J].Genomics,2001,71(2):163-173

[9]Maestro R,Dei Tos AP,Hamamori Y,et al.Twist is a potential oncogene that inhibits apoptosis[J].Gene Develop,1999,13:2207-2217