李朝品，石 连，李秋雨，姜玉新

2.安徽理工大学医学院病原生物与免疫学教研室，淮南232001

过敏性哮喘为临床常见病、多发病，而粉尘螨Ⅰ 类变应原（Derf1）是诱发过敏性哮喘最重要的变应原［1］。变应原特异性免疫治疗（Allergen－specific immunotherapy，ASIT）是目前治疗过敏性哮喘的唯一病因疗法［2］，但目前进行ASIT所用的变应原浸液成分复杂、易产生副作用［2－3］，因此变应原的制备必须标准化［1－2］。重组DNA技术可实现变应原的标准化［3］，并提高 ASIT的安全性［4］。本文拟将粉尘螨Ⅰ类变应原基因Derf1构建于瞬时表达载体TRBO（TMV RNA－based overexpression）中，通过PCR、测序、酶切等分子生物学技术鉴定后，侵染烟草叶片，观察其表达情况，以期获得表达于烟草的Der f 1蛋白，为后期大规模生产粉尘螨变应原疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 粉尘螨 从芜湖某面粉厂的地角粉中分离获得，经形态学鉴定证实为粉尘螨，并进行大规模培养。

1.1.2 本 氏 烟 （Nicotianabenthamiana）：8～12 w，由本实验室种植。

1.1.3 菌株E.coliDH－5α为本实验室保存；根癌农杆菌GV1301株由浙江大学生物技术研究所吴建祥教授惠赠。

1.1.4 质粒 p MD18－T载体购自 Ta KaRa公司；TRBO质粒由浙江大学生物技术研究所吴建祥教授惠赠。

1.1.5 引物 根据 GenBank公布的Derf1（EF139429.1）基因序列设计特异引物，上游引物：5′－ATG GAT CCA GCG CTT GCC GTA TCA ATT CGG TTA AC－3′，下 游 引 物：5′－CTC GAG GTT GTT TCC GGC TTG GAA ATA TCC G－3′，并引入PacI和NotI酶切位点，由生工生物工程（上海）有限公司合成。扩增片段长度为627 bp。

1.1.6 工具酶TaqDNA聚合酶及高保真即用PCR扩增试剂盒、限制性内切酶PacI和NotI购自生工生物工程（上海）有限公司；T4DNA连接酶购自TAKARA公司；MMLV first strand cDNA synthesis Kit购自BBI（加拿大）公司。

1.1.7 主要试剂 Trizol®购自Invitrogen公司；硝酸纤维素膜、氨苄青霉素和卡那霉素购自BBI（加拿大）公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、San－Prep柱式PCR产物纯化试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、100 bp DNA ladder、DAB显色试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；……