李朝品，石 连，李秋雨，姜玉新

2.安徽理工大学医学院病原生物与免疫学教研室，淮南232001

过敏性哮喘为临床常见病、多发病，而粉尘螨Ⅰ 类变应原（Derf1）是诱发过敏性哮喘最重要的变应原［1］。变应原特异性免疫治疗（Allergen－specific immunotherapy，ASIT）是目前治疗过敏性哮喘的唯一病因疗法［2］，但目前进行ASIT所用的变应原浸液成分复杂、易产生副作用［2－3］，因此变应原的制备必须标准化［1－2］。重组DNA技术可实现变应原的标准化［3］，并提高 ASIT的安全性［4］。本文拟将粉尘螨Ⅰ类变应原基因Derf1构建于瞬时表达载体TRBO（TMV RNA－based overexpression）中，通过PCR、测序、酶切等分子生物学技术鉴定后，侵染烟草叶片，观察其表达情况，以期获得表达于烟草的Der f 1蛋白，为后期大规模生产粉尘螨变应原疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 粉尘螨 从芜湖某面粉厂的地角粉中分离获得，经形态学鉴定证实为粉尘螨，并进行大规模培养。

1.1.2 本 氏 烟 （Nicotianabenthamiana）：8～12 w，由本实验室种植。

1.1.3 菌株E.coliDH－5α为本实验室保存；根癌农杆菌GV1301株由浙江大学生物技术研究所吴建祥教授惠赠。

1.1.4 质粒 p MD18－T载体购自 Ta KaRa公司；TRBO质粒由浙江大学生物技术研究所吴建祥教授惠赠。

1.1.5 引物 根据 GenBank公布的Derf1（EF139429.1）基因序列设计特异引物，上游引物：5′－ATG GAT CCA GCG CTT GCC GTA TCA ATT CGG TTA AC－3′，下 游 引 物：5′－CTC GAG GTT GTT TCC GGC TTG GAA ATA TCC G－3′，并引入PacI和NotI酶切位点，由生工生物工程（上海）有限公司合成。扩增片段长度为627 bp。

1.1.6 工具酶TaqDNA聚合酶及高保真即用PCR扩增试剂盒、限制性内切酶PacI和NotI购自生工生物工程（上海）有限公司；T4DNA连接酶购自TAKARA公司；MMLV first strand cDNA synthesis Kit购自BBI（加拿大）公司。

1.1.7 主要试剂 Trizol®购自Invitrogen公司；硝酸纤维素膜、氨苄青霉素和卡那霉素购自BBI（加拿大）公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、San－Prep柱式PCR产物纯化试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、100 bp DNA ladder、DAB显色试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；DL2000 DNA Marker购自 Ta KaRa公司；PacI、NotI、PageRuler®Unstained Protein Ladder（SM0661）购自 Fermentas公司；抗β－actin抗体、HRP标记的羊抗兔二抗购自Sigma公司；兔抗Der f 1抗体为本实验室保存；其他均为国产分析纯。

1.1.8 主要仪器 Beckman高速冷冻离心机，Bio－Rad水平和垂直电泳仪、细菌培养箱、Syngene G：BOX化学发光荧光凝胶成像系统、BTX ECM630电击转化仪。

1.2 方法

1.2.1Derf1基因的扩增 根据粉尘螨避光的特性，收集约500只用Trizol®一步法提取总RNA。Derf1基因的反转录反应：粉尘螨总RNA 2μL，Oligo（d T）18引物（0.5μg/μL）1μL，dd H2O 9μL，70℃预变性5 min，冰浴30s，加入5×反应缓冲液4 μL，RNase inhibitor（20 U/μL）1μL，d NTP Mixture（10 mmol/L）2μL，充分混匀后，37℃孵育5 min。加入 MMLV reverse transcriptase（20 U/μL）1μL，37℃孵育60 min。70℃灭活逆转录酶。PCR体系（20μL）为：cDNA 1μL，10×PCR Buffer 1 μL，d NTP Mixture 1μL，Derf1上、下游引物各1 μL，TaqDNA polymerase（5 U/μL）1μL，dd H2O 14 μL。反应条件：94℃4 min，94℃30 s，55℃45 s，72℃1 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min。RT－PCR产物行1.0%琼脂糖凝胶（含0.5μg/m L的溴化乙锭，下同）电泳，用DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段。

1.2.2Derf1基因克隆载体的连接及测序鉴定

将RT－PCR产物和p MD18－T载体按1∶8的摩尔浓度比用T4DNA连接酶16℃连接12 h，将连接产物电击转化入感受态E.coliDH－5α中。电击条件为电压2 500 V，电阻100Ω，电容50μF。后涂布含氨苄青霉素（50μg/m L）的LB板，37℃过夜。随机挑取克隆进行质粒提取、PCR扩增及PacI和NotI双酶切鉴定，PCR反应体系及反应条件同1.2.1所述；酶切体系（20μL）按说明书进行，操作如下：p MD18－T－Derf1模板5μL，10×酶切缓冲液2 μL，10×BSA（0.1 mg/m L）2μL，PacI（10 U/μL）1 μL，NotI（10 U/μL）1μL，dd H2O 9μL；混匀后37℃反应3 h，酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，阳性克隆进行测序验证，由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2.3 质粒TRBO的扩增 将含TRBO的E.coliDH－5（接种在含50μg/m L卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜。按照说明书进行质粒抽提。

1.2.4 重组质粒TRBO－Derf1的构建及电击转化 按常规方法进行目的基因和载体的制备及连接，并根据1.2.2所述的条件电击转化根癌农杆菌（A.tumefaciens）GV1301菌株。

1.2.5 重组质粒TRBO－Derf1的PCR及酶切鉴定 以从A.tumefaciens中抽提的重组质粒TRBO－Derf1为模板进行PCR。同时用PacI和NotI对重组质粒进行双酶切，酶切体系按照说明书进行，同1.2.2所述。

1.2.6 Der f 1在烟草叶片中的表达 挑取含TRBO－Derf1重组质粒的GV1301阳性克隆于含抗生素（Km＋Rif，各50μg/m L）的YEP液体培养基培养至OD600≈0.5，3000×g离心10min收集菌体，无菌水重悬，再次离心收集菌体，用含终浓度为10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES（p H5.6）和200μmol/L乙酰丁香酮（As）的无菌水重悬浮，调整菌液浓度至OD600≈1.0，室温下放置3 h；用1 m L注射器针头在烟草叶片背面刺2个小孔，按住叶面小孔处，用无针头的针管将菌液沿小孔慢慢注入叶片组织空隙。取接种3、4、5、6 d后的烟草叶片（同时设健康植株为对照）；按1∶4（w/v）加入提取缓冲液（50 mmol/L phosphate，p H 8.0；10 mmol/L Tris，p H 8.0；500 mmol/L NaCl；0.1%Tween－20；0.1%NP－40；0.1% β－巯 基 乙 醇；1 mmol/L PMSF），研磨数分钟；4℃12 000×g离心20 min；取上清，进行SDS－PAGE（12.5%）电泳检测。

1.2.7 Western blot鉴定 取15μL上述提取的总蛋白，加等体积的2×SDS加样缓冲液混合，沸水浴10 min，冰浴冷却进行SDS－PAGE电泳（分离胶浓度为12.5%）。将蛋白转移至硝酸纤维膜。以5%脱脂牛奶的PBST（含0.01%的 Tween－20的PBS缓冲液）37℃封闭转移膜1 h，加1∶25 00倍稀释液的Der f 1抗体为一抗，室温孵育1 h，PBST洗膜5 min/次，共5次，用HRP酶标二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，PBST洗膜5 min/次，共5次，用DAB底物进行显色。出现条带立即中止反应，拍照。设2次独立的重复试验以验证结果的可靠性。

2 结 果

2.1Derf1基因的 RT－PCR 扩增 RT－PCR 扩增产物的电泳结果显示在500～750 bp之间有一条清晰条带，其大小与预期的Derf1基因片段大小基本一致，见图1。

2.2Derf1基因克隆载体的鉴定 将载体p MD18－T和 RT－PCR 产物连接后转化 DH－5α，挑选单个菌落进行PCR扩增以及PacI和NotI双酶切鉴定，电泳结果显示获得了相应大小的扩增片段（图2）和酶切片段（图3），表明重组克隆载体已成功构建。阳性菌落测序，经BLAST序列比对分析确认为Derf1基因，进一步表明已成功克隆Derf1基因。

图1 Der f 1的RT－PCR产物M：DL2000分子量标准；1：Der f 1基因 RT－PCR产物；2：阴性对照Fig.1 Product of Der f 1 by RT－PCR M：DL2000 DNA marker；1：RT－PCR product of Der f 1；2：Negative control

图2 重组质粒p MD18－T－Der f 1的PCR鉴定M：DL 2000分子量标准；1、2、4：含重组质粒p MD18－T－Der f 1的阳性菌；3：阴性菌Fig.2 Identification of recombinant plasmid p MD18－TDer f 1 by PCRM：DL 2000 DNA marker；1，2，4：Positive bacterial colonies containing recombinant plasmid p MD18－T－Der f 1；3：Negative bacterial colony

2.3 重组质粒TRBO－Derf1的PCR鉴定 将载体TRBO和基因片段Derf1的酶切产物连接后转化GV1301菌株，随机挑取单菌落行PCR反应，可扩增出大小为627bp左右的目的基因片段（图4）。2.4 重组质粒TRBO－Derf1的双酶切鉴定 经PacI和NotI双酶切后，电泳结果显示质粒TRBO呈现唯一条带，而重组质粒TRBO－Derf1则分别呈现TRBO载体片段和627bp大小的Derf1基因片段（图5）。

2.5 重组质粒TRBO－Derf1在烟草叶片中的表达 含重组质粒TRBO－Derf1的GV1301菌株注射本氏烟草叶片3、4、5、6 d后提取烟草总蛋白，进行SDS－PAGE电泳，结果显示，在注射后的5 d和6 d Der f 1蛋白的表达明显升高（图6），且大小与预期大小相一致（约25 k D），表明Der f 1蛋白可成功表达于烟草叶片中。Western blot进一步得到证实（图7）。

图3 重组质粒p MD18－T－Der f 1的酶切结果M：DL2，000分子量标准；1：Pac I和Not I双酶切空质粒p MD18－T；2，3：Pac I和 Not I双 酶 切 重 组 质 粒p MD18－T－Der f 1Fig.3 Double digestion of p MD18－T－Der f 1 plasmids by Pac I and Not IM：DL2000 DNA marker；1：p MD18－T plasmid double digested by Pac I and Not I；2，3：Recombinant plasmid p MD18－T－Der f 1 double digestion by Pac I and Not I

图4 重组质粒TRBO－Der f 1的PCR鉴定M：DL 2000分子量标准；1－4：含重组质粒 TRBO－Der f 1的阳性菌Fig.4 Identification of recombinant plasmid TRBO－Der f 1 by PCRM：DL2000 DNA marker；1－4：Positive bacteria colonies containing recombinant plasmid TRBO－Der f 1

图5 重组质粒TRBO－Der f 1的酶切鉴定结果M：100 bp DNA ladder；1：Der f 1基因 PCR 产物；2：TRBO空载体；3：重组质粒TRBO－Der f 1的Pac I和Not I双酶切产物Fig.5 Double digestion of p MD18－T－Der f 1 plasmids by Pac I and Not IM：100 bp DNA ladder；1：PCR products of Der f 1 gene；2：TRBO plasmid double digested by Pac I and Not I；3：Recombinant plasmid TRBO－Der f 1 double digested by Pac I and Not I

图6 接种不同时间烟草总蛋白中Der f 1蛋白的检测M：蛋白 Marker；1：未处理烟草；2－5：分别为 GV1301侵染3、4、5、6 d的烟草总蛋白Fig.6 Detection of Der f 1 protein from total protein in tobacco leaves harvested at different timeM：Protein marker；1：Untreated tobacco；2－5：Total protein in tobacco leaves harvested at 3，4，5 and 6 day after infiltration

图7 Western blot验证接种不同时间烟草总蛋白中Der f 1蛋白M：蛋白 Marker；1：未处理烟草；2－5：分别为 GV1301侵染3、4、5、6 d的烟草总蛋白Fig.7 Detection of Der f 1 protein from total protein in tobacco leaves harvested at different time by Western blotM：Protein marker；1：Untreated tobacco；2－5：Total protein in tobacco leaves harvested at 3，4，5 and 6 day after infiltration

3 讨 论

粉尘螨是常见的气传变应原，可引起哮喘、过敏性鼻炎、异位性皮炎等多种变态反应性疾病，80%左右的哮喘患者对尘螨过敏［5－6］，其中粉尘螨Ⅰ类变应原是最主要的变应原之一。ASIT是唯一可改善变应性疾病自然病程且疗效显著的治疗措施。但尘螨变应原粗浸液因成分复杂、易产生严重的副作用等原因使其应用受到限制，故应用基因工程技术研制标准化的尘螨变应原疫苗备受关注［7－8］。本文用RT－PCR方法以Derf1基因的特异性引物从粉尘螨总RNA中克隆出Derf1基因，测序并经BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）序列比对分析后，进一步确认为Derf1基因，为标准化的粉尘螨变应原疫苗的制备提供基础材料。

用分子生物学技术从原材料中大规模分离纯化变应原耗时长、成本高、难以解决纯度和避免副反应等问题的发生［9－10］，因而难以满足其实际需要。转基因植物在药用蛋白中的应用越来越受重视［10］。植物生物反应器作为一种安全、便捷和经济转基因重组蛋白生产系统而被广泛接受，并成功应用于抗体、疫苗、工业酶、生物多糖等的生产。其中，烟草是重要的植物反应器之一。烟草花叶病毒（TMV）可侵染多种植物并能高水平复制而被广泛用作载体表达外源基因。TRBO（TMV RNA－based overexpression）载体为改进型的TMV载体，具有转染效率高、外源蛋白高表达等特点［11－12］，是生产外源重组蛋白的较好选择。本研究利用分子生物学技术将Derf1基因正向插入到TRBO载体中，通过PCR、双酶切等生物学方法鉴定后，表明该基因已克隆入TRBO载体，并成功转化到了农杆菌GV1301菌株中。接种本氏烟草叶片后在第5 d和6 d可见Der f 1蛋白明显表达，并通过Western blot得到进一步验证，为在烟草中的大规模表达Der f 1蛋白奠定了基础。目前正大规模分离纯化Der f 1蛋白并进行过敏性哮喘的变应原特异性免疫治疗的动物实验研究，检测其过敏原性及免疫原性，探讨其临床应用前景。

［1］Yasuhara T，Takm T，Yuuki T，et al.Cloning and expression of cDNA encoding the complete prepro－form of all isoform ofDer f1，the major group 1 allergen from house dust miteDermatophagoidesfarinae［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2001，65（3）：563－569.DOI：10.1271/bbb.65.563

［2］Bousquet J，Lockey R，Malling HJ.Allergen immunotherapy：therapeutic vaccines for allergic diseases.A WHO position paper［J］.J Allergy Clin Immunol，1998，102（4 Pt 1）：558－562.DOI：10.1111/j.1398－9995.1998.tb04930.x

［3］Valenta R.The future of antigen－specific immunotherapy of allergy［J］.Nat Rev Immunol，2002，2（6）：446－453.DOI：10.1038/nri824

［4］Akdis CA，Blaser K.Bypassing IgE and targeting T cells for specific immunotherapy of allergy［J］.Trends Immunol，2001，22（4）：175－178.DOI：10.1016/S1471－4906（01）01862－2

［5］Arlian LG，Platts－Mills TA.The biology of dust mites and the remediation of mite allergens in allergic disease［J］.J Allergy Clin Immunol，2001，107（3 Suppl）：S406－413.DOI：10.1067/mai.2001.113670

［6］Pittner G，Vrtala S，Thomas WR，et al.Component－resolved diagnosis of house－dust mite allergy with purified natural and recombinant mite allergens［J］.Clin Exp Allergy，2004，34（4）：597－603.DOI：10.1111/j.1365－2222.2004.1930.x

［7］Kussebi F，Karamloo F，Rhyner C，et al.A major allergen genefusion protein for potential usage in allergen－specific immunotherapy［J］.J Allergy Clin Immunol，2005，115（2）：323－329.DOI：10.1016/j.jaci.2004.11.041

［8］Burtin D，Chabre H，Olagnier B，et al.Production of native and modified recombinantDerp1 molecules in tobacco plants［J］.Clin Exp Allergy，2009，39（5）：760－670.DOI：10.1111/j.1365－2222.2009.03201.x

［9］Avesani L，Bortesi L，Santi L，et al.Plant－made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases：where are we［J］.Expert Rev Vaccines，2010，9（8）：957－969.DOI：10.1586/erv.10.82

［10］Decker EL，Reski R.Moss bioreactors producing improved biopharmaceuticals［J］.Curr Opin Biotechnol，2007，18（5）：393－398.DOI：10.1016/j.copbio.2007.07.012

［11］Lindbo JA.TRBO：A high－efficiency tobacco mosaic virus RNA－based overexpression vector［J］.Plant Physiol，2007，145（4）：1232－1240.DOI：10.1104/pp.107.

［12］Streatfield SJ，Howard JA.Plant production systems for vaccines［J］.Vaccine，2003，2（6）：763－775.DOI：10.1586/14760584.2.6.763