杨 蓉，许冠群，王学锋，丁秋兰，吴 方

（上海交通大学医学院附属瑞金医院 老年科，上海 200025）

vWD2N型诊断试验的新探索

杨 蓉，许冠群，王学锋，丁秋兰，吴 方＊

（上海交通大学医学院附属瑞金医院 老年科，上海 200025）

目的 血管性血友病（von Willebrand disease，vWD）分3型，各型具有不同的病理生理机制、临床特点、治疗方法，为了更好的治疗，需要明确其分型。vWF：FⅧ结合试验（vWF：FⅧ）可作为vWD2N型的确诊实验之一。方法对20例vWD患者进行改良的vWF：FⅧ结合试验，及各种vWD分型实验，对结合试验诊断为vWD2N型患者的血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）所有外显子及其侧翼序列进行基因序列分析，以此评价改良的结合实验对vWD2N型诊断的准确性。结果对20例vWD患者进行改良的vWF：FⅧ结合试验结果为FⅧ结合正常者10例，FⅧ结合减少者8例，FⅧ结合缺失者2例。对FⅧ结合缺失2例患者进行的vWF 52个外显子基因及其侧翼序列进行检测，分别发现基因突变E15 72648-72653insCCGTG杂合、E25 106026C＞T（T1122M）杂合，故这两例患者可确诊为vWD2N型。结论本文中所建立的改良的vWF：FⅧ结合试验可以较好的确诊vWD2N型。

血管性血友病；血管性血友病2N型；vWF：FⅧ结合试验；血管性血友病因子；基因检测

（ChinJLabDiagn，2012，16：0265）

血管性血友病（von Willebrand disease，vWD）2N型是vWD的一个亚型，是由于血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）与FⅧ的结合位点突变引起vWF与FⅧ结合障碍，使得FⅧ快速降解而导致的一种出血性疾病。vWD各型、各亚型间具有不同的生理病理机制，其临床特征与治疗方法也各不相同。vWD2N型诊断依赖于vWF：FⅧ结合试验（vWF：FⅧ），而国内尚无标准化的vWF：FⅧ结合试验方法。本文拟建立了改良的vWF：FⅧ结合试验，并对20例vWD患者进行vWF：FⅧ结合试验检测，同时对该方法诊断的vWD2N型患者进行基因诊断，以验证该方法的准确性。

1 材料与方法

1.1 研究对象2008年9月-2009年5月就诊于上海交通大学医学院附属瑞金医院血管性血友病患者20例，均按ISTH制定的vWD诊断标准诊断，其中vWD 2N型主要依据本文建立的方法诊断。FⅧ活性（FⅧ：C）、vWF抗原（vWF：Ag）、瑞士托霉素辅因子活性测定（vWF：ROC）、瑞士托霉素诱导的血小板聚集（RIPA）及vWF胶原结合试验（vWF：CB）参见参考文献［1］。

1.2 vWF：FⅧ结合试验方法建立

1.2.1 vWF：FⅧ结合试验（vWF：FⅧ）原理 本实验基于酶联免疫反应的原理，在体外检测vWF与FⅧ结合能力。vWF与重组的FⅧ结合，以排除自身FⅧ浓度对两者的结合情况的影响。

1.2.2 vWF：FⅧ结合试验（vWF：FⅧ）方法 （1）试剂：ELISA板、包被抗体、重组FⅧ、牛血清白蛋白（BSA）、NaCL、Tris-Base、正常人血浆、显色工具、Tween 20、CaCL2、包被buffer、20%乙酸。（2）仪器：37℃恒温孵育箱、ELISA板计数器和清洗器、吸管、绝缘容器、酶标仪。（3）步骤：包被ELISA板→配置缓冲液→加样→去除内源性FⅧ，加入重组FⅧ→FⅧ发射底物显色→将ELISA板放入酶标仪，在405nm处读数→将同一份样本不通稀释度所得吸光度结果作图，进行待测样本与正常人、阳性对照结果的比对。

判断标准：结果分为FⅧ结合正常、减少、缺失三种类型，判断标准为：结合率≧1为FⅧ结合正常，0.1＜结合率＜1为FⅧ结合减少，结合率≦0.1为FⅧ结合缺失。

1.3 对疑似vWD2N型患者的vWF 52个外显子基因进行检测。

2 结果

2.1 vWF：FⅧ结合试验结果

2.1.1 正常人vWF FⅧ结合试验结果如图1所示，其结合率大于1，多次重复测定，其结合率为1.4143±0.2549，95% 可 信 区 间 为 （1.0977，1.7309）。

2.1.2 阳性对照vWF FⅧ结合试验结果如图2所示，其结合率小于0.1，多次重复测定，其斜率为0.0606±0.016，95%可信区间为（0.0203，0.0965）。

图2 阳性对照vWF：FⅧ结合试验结果

2.1.3 患者vWF FⅧ结合试验结果为FⅧ结合正常者10例，FⅧ结合减少者8例，FⅧ结合缺失者2例（见表1）。

表1 患者vWF：FⅧ结合试验结果

2.2 根据vWD分型检测试验及vWFFⅧ结果对入选的vWD患者进行分型，结果如表2所示（略去与本研究无关的分型试验结果）。

2.3 基因检测结果对疑似vWD2N型的2例患者进行的vWF 52个外显子基因进行检测，分别发现 基 因 突 变 E15 72648-72653insCCGTG、E25 106026C＞T（T1122M）（见表 3）。E15 72648-72653insCCGTG位于常见vWD2N型突变（E18-E28）的上游，其改变会影响到下游序列的表达，影响vWF与FⅧ结合。E25 106026C＞T（T1122M）位于D′-D3区即位于vWF与FⅧ结合区域，故我们可认为两例患者均为vWD2N型。

表2 患者一般情况

表3 基因检测结果

3 讨论

血管性血友病因子（Von Willebrand Factor，vWF）是血管内皮细胞和骨髓巨核细胞合成的一种糖蛋白，存在于血浆与血小板中。vWF基因位于12号染色体，全长178kb，由52个外显子和51个内含子组成。vWF的正常生理功能包括：①通过与血小板糖蛋白（GP）Ⅰb和Ⅱb－Ⅲa结合，促使血小板聚集；还可以介导血小板黏附到损伤内皮细胞暴露的胶原表面，这些效应加速了血小板血栓的形成，在止血过程中起重要的作用。②作为FⅧ的载体，其与FⅧ结合后能使FⅧ在血浆中保持稳定，在凝血中具有重要的作用［2，3］。

vWD2N型是血管性血友病（von Willebrand disease，vWD）的一种亚型。由于vWD2N型患者FⅧ难以和vWF结合，而被快速降解，其出血症状与血友病A（Heamophilia A，HA）相似，FⅧ：C下降，出血时间可正常，vWF：Ag和vWF：Act可正常。vWD2N型很容易被误诊为HA，为了鉴别vWD2N型与HA也很有必要进行vWF：FⅧ结合试验。该实验测定vWF与外源性重组FⅧ的结合能力，主要用于区分vWD2N型与中、重度血友病A［4］。

Nishino等［5］于1989年提出了测定vWF：FⅧ的方法，其他一些学者［6，7］又陆续改良了vWF：FⅧ的测定方法。我们认为vWF：FⅧ结合试验是一项优先于突变分析的重要筛选试验，它不仅可以鉴别vWD2N型，也可以鉴别vWD2N型与vWD1型或vWD2型其它亚型突变的混合型［8，9］。本文所采取的是改良的vWF：FⅧ结合试验，其主要的特点是①将患者血浆对倍稀释，这样可以降低vWF：Ag对其与FⅧ结合的影响；②使用FⅧ发射底物试剂盒检测，与酶标法相比，可以提高反应的灵敏性；③不需分别检测vWF：Ag与结合FⅧ的量，只需一次检测即可得到结果，操作更加简便。我们的研究表明用正常人vWF：FⅧ为1.4143±0.2549，1.0000可以作为vWF：FⅧ的正常下限，与Caron等［7］的研究结果相似。在本研究中，vWD2N型vWF：FⅧ为0.0216±0.0183，vWD其它型vWF：FⅧ结合为0.3957±0.0914，vWD2N型患者与其它亚型血友病有着明显的差别。而且我们对该方法诊断的疑似vWD2N型的2例患者的vWF基因检测结果表明2例患者确为vWD2N型。因此，我们建议vWF：FⅧ＜0.1者都应该进行基因检测，以明确是否为vWD2N型。

在本文和其它一些文章中，vWF：FⅧ不能单独地解释vWD2N型中FⅧ：C水平的变异，这时应该考虑患者的血型。ABO血型可以影响vWF：Ag的水平，进而影响FⅧ：C的高低。O型血的人往往比其它血型的人FⅧ：C水平低型［10］。因此，需要更进一步的研究去评估携带vWD2N型突变个体中FⅧ：C水平与血型之间的关系。

我们的研究认为vWF：FⅧ试验是一个精确的、敏感的和特异的试验，其结果不受vWF：Ag的影响，有助于vWD患者中区分出2N型，还可以帮助鉴别vWD2N型和HA患者。本试验排除了普通的出血、服用抗凝药者，及狼疮抗凝物质的干扰，但是FⅧ和vWF抑制物的干扰需要进一步的研究。

［1］谢飞，王鸿利，王学锋.血管性血友病诊断与分型方法的建立［J］.中华检验医学杂志 ，2006，29（9）：804.

［2］Melldolicchio GL，Ruggen ZM.New perspectives on von Willebrand factor functions in hemostasis and tlrombosis［J］.Semin Hematol，2005，42：5.

［3］Franchini M，Lippi G.von Willebrand factor and thrombosis［J］.Ann Hematol，2006，28.

［4］Taylor SL，Bromidge E，Savidge GF.Evaluation of an automated screening assay for von willebrand Disease type2N［J］.Clinical ＆Laboratory Hematology，2002，24：369.

［5］Nishino M，Girma JP，Rothschild C，et al.New variant of von Willebrand disease with defective binding to factor VIII［J］.Blood，1989，74：1591.

［6］Casonato A，Pontara E，Zerbinati P，et al.The evaluation of factor VIII binding activity of von Willebrand factor by means of an ELISA：significance and practical implications［J］.Am J Clin Pathol，1998，109：347.

［7］Caron C，Mazurier C，Goudemand J.Large experience with a factor VIII binding assay of plasma von Willebrand factor using commercial reagents［J］.Br J Haematol，2002，117：716.

［8］Mazurier C，Goudemand J，Hilbert L，et al.Type 2Nvon Wille-brand disease：clinical manifestations，pathophysiology，laboratory diagnosis and molecular biology［J］.Best Pract Res Clin Haematol，2001，14：337.

［9］Asatiani E，Kessler CM.Multiple congenital coagulopathies coexpressed with Von Willebrand’s disease：the experience of Hemophilia Region III Treatment Centers over 25years and review of the literature［J］.Haemophilia，2007，13：685.

［10］Schleef M，Strobel E，Dick A，et al.Relationship between ABO and Secretor genotype with plasma levels of factor VIII and von Willebrand factor in thrombosis patients and control individuals［J］.Br J Haematol，2005，128：100.

The new diagnostic test of vWD2N

YANGRong，XUGuan-qun，WANGXue-feng，etal.（DepartmentofGeriatric andclinicalbloodtransfusion，RuijinHospital，ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai200025，China）

ObjectiveThe von Willebrand disease（vWD）is generally divided into three types，which has different physiopathologic mechanisms，clinical features，and treatment methods.For accurcte treatment，we need to identify their types.The vWF：FⅧbinding assay is one of the diagnosis test for vWD2N.MethodsThe improved vWF：FⅧbinding assay and vWD classification assays were preformed in twenty patients with vWD.The sequences of all the exons and exons-intron boundaries of the von Willebrand factor gene were amplified by PCR and by direct sequencing in the patients with vWD2Ndiagnosed by vWF：FⅧbinding assay.ResultsThe results of vWF：FⅧbinding assay showed that vWF：FⅧ binding assay was normal in ten patients reduced in eight patients，deleted in two patients.The gene mutations of E15 72648-72653insCCGTG、E25 106026C＞T（T1122M）were identified by the genetic testing of 52exon of vWF in the two patients who are suspected of vWD2N.The results displays that they are truely the type of vWD2N.ConclusionThe improved the vWF：FⅧbinding assay may be a better method to diagnose the vWD2N.

von Willebrand disease；von Willebrand disease 2N；vWF：FⅧbinding assay；von Willebrand Factor；genetic testing

R554＋.1

A

1007－4287（2012）02－0265－04

＊通讯作者

2011－09－21）