王 芳，伦永志

（1. 大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622；2. 大连大学 医学院 辽宁省高校生物物理学重点实验室，辽宁 大连 116622）

从原核生物到真核生物，基因组中重复序列的数目呈递增趋势。重复序列的作用目前还不完全清楚，但重复序列不是冗余或者“无用”DNA，而是与生物的进化、遗传和变异密切相关，同时它还对基因表现、转录调控、染色体构建及生理代谢都起着极其重要的作用[1]。1990年，Sharples等[2]在分析大肠埃希菌（Escherichia coli）基因组中tsl基因的3'端时发现的一种基因间重复序列，命名为“基因间重复序列”（intergenic repetitive unit，IRU）。之后 Hulton等[3]在鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）、假结核耶尔森菌（Yersinia pseudotuberculosis）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和霍乱弧菌（Vibrio cholerae）基因组中也发现了同样高度保守的重复序列。由于该序列主要存在于肠杆菌科细菌中，故称之为“肠道细菌基因间重复序列”（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus,ERIC）。ERIC是诸多重复序列中的一种。针对ERIC建立起来的PCR技术已广泛使用，本文着重对ERIC-PCR技术临床应用现状做一综述。

1 ERIC-PCR技术

ERIC长约127bp，其中包含几个反向重复序列，具有非常保守的中央倒置重复区，有的还有插入序列。ERIC散在分布在细菌基因组中，尚未在噬菌体和质粒上发现[4]。人们在研究 ERIC（IRU）时多采用Hulton提出的序列，有所不同的是在第127位加上碱基“A”[5]。ERIC-PCR技术是在随机扩增多态性DNA（RAPD）检测技术上建立起来的，本质上是一种长引物的 RAPD技术。Versalovic等[6]以ERIC中部反向重复序列为结合位点，设计了一组反向引物（ERIC1R 5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’；ERIC2 5’-AAGTAAGTGACT GGGGTGAGCG-3’），可用于扩增细菌基因组中两个相邻ERIC序列间的片段，由于ERIC在不同细菌基因组上重复序列的数目和分布不同，从而得到由一系列大小不同的DNA片段组成的指纹图谱，用于区别不同细菌的基因组。ERIC-PCR指纹图谱具有很高的稳定性，不同地域和不同年代的同一菌株的指纹图谱保持一致[7]。采用不同方法提取细菌基因组，所获得的指纹图谱具有良好的重复性[8]。ERIC-PCR技术具有很高的灵敏度，在混合菌液中，当一种细菌达到总菌量的0.5%时即可被检测出来；混合菌液的指纹图谱为各种纯菌指纹图谱的重叠相加，同样具有稳定性[9]。

2 单个菌株的基因组多态性分析

ERIC-PCR指纹图谱能够反映出细菌整个基因组的组成，具有很强的鉴别细菌菌株和亚种的能力[10]。利用ERIC-PCR技术对细菌进行基因组多态性分析，可用于细菌基因分型、细菌耐药谱与基因型之间的关系研究、流行病学调查和传染源追踪。

Wolska等[11]采用 PCR核糖体分型和ERICPCR两种方法对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）临床分离株进行基因分型，分别获得9和36个基因型，结果提示ERIC-PCR方法比 PCR核糖体分型方法和传统的血清学分型方法具有更强的区分能力。Souza等[12]运用ERIC-PCR、脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE）、16S rRNA和多位点序列分析（Multilocus Sequence Analysis, MLSA）四种分子技术对耶尔森菌进行分类与鉴定，结果表明ERIC-PCR、16S rRNA和MLSA是耶尔森菌分类与鉴定的重要工具，而PFGE不能用于分类。相比于16S rRNA和MLSA，ERIC-PCR具有更便宜、更简单、更快速的特点，被认为是耶尔森菌传统分类方法的一种替代技术。

Nath等[13]研究分离自1987～2006年间的伤寒患者的 113株伤寒沙门菌，使用随机扩增多态DNA（Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD）和 ERIC-PCR两种方法进行基因分型。对随机抽取的 33株伤寒沙门菌进行分析，ERIC-PCR分辨率高于RAPD，重复率达100%，被认为是一种更有效的分析方法。利用ERIC-PCR技术将33株细菌分成Ⅰ型和Ⅱ型两大类型，Ⅰ型又分为四个亚型Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc和Ⅰd。Ⅰa亚型中的菌株均对环丙沙星（CIP）敏感；Ⅰb和Ⅰc亚型中既含有CIP敏感株又含有CIP耐药株；Ⅰd亚型中的菌株均对CIP耐药。ERIC-PCR技术将任意抽取的89株伤寒沙门菌分成71个基因型，表明伤寒沙门菌基因组具有快速变化和变异的能力。Viana等[14]对一所医院两个时期（1994～1996年和2004～2007年）的150株鲍曼不动杆菌分离株进行药物敏感性实验和ERIC-PCR基因分型，鲍曼不动杆菌分离株来源于医院环境和住院病人。结果表明耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌由2%上升到73%；ERIC-PCR技术将鲍曼不动杆菌分为 38个基因型。研究结果表明耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的流行不是由一个基因型细菌传播引起的，两个时期分别分离的相同基因型菌株显示鲍曼不动杆菌可存在于医院环境中数年，一旦获得另外的耐药基因便更容易流行。

Goel等[15]应用ERIC-PCR技术对2005年发生在印度的霍乱疫情进行了研究，主要获得两种指纹图谱，分别对应两个疫情高峰，结果表明这次霍乱疫情是由降雨带来的两个不同基因型霍乱弧菌引起的。Reza Ranjbar等[16]对发生在伊朗加兹温的一起食物中毒事件进行了流行病学调查，结果从水样和部分入院治疗患者的粪便标本中分离得到霍乱弧菌，采用ERIC-PCR技术分析霍乱弧菌之间的亲缘关系，结果显示引起这次霍乱暴发的霍乱弧菌源于同一克隆，而井水是传染源。

3 微生物群落结构的分析

微生物群落结构中的细菌数目少则几种到几十种，多则几百种。如果微生物群落结构中的细菌种类较多，传统方法便束手无策。而ERIC-PCR指纹图谱可以反映微生物群落的种群多样性与结构特征，可用于微生物群落结构的多样性分析、观察微生物群落结构的动态变化及对不同微生物群落结构进行差异性分析。

Singh等[17]研究糖尿病足的细菌感染情况，ERIC-PCR技术可将用传统方法分离得到的38株细菌分成 34个基因型，其中传统方法鉴定为两种类型的同种细菌利用ERIC-PCR技术则区分为8个基因型，因此ERIC-PCR技术相对于传统分类方法是一种更敏感的检测方法。

Yang等[18]对比分析了急性酒精性肝损伤模型组、健脾活血方干预组、健康对照组大鼠肠道菌群结构的ERIC-PCR指纹图谱，从分子水平观察了三个实验组大鼠肠道菌群结构的组间差异和个体差异。聚类分析显示模型组大鼠肠道微生物群落结构发生明显变化，而健脾活血方能调节肠道菌群，能在一定程度上恢复大鼠肠道菌群的正常结构。

4 结语

相对于细菌分类的传统方法和其它分子生物学技术，ERIC-PCR是一种经济实用的分子生物学方法。ERIC-PCR技术能够有效区分细菌菌株间的差异性，特别是在流行病学调查和传染源追踪方面具有重要价值。肠道菌群结构的变化常与疾病的发生、发展相关，ERIC-PCR指纹图谱能够精确反映出这种变化，从而成为研究肠道菌群结构的有力工具。总之，ERIC-PCR技术在临床上有广泛的应用前景。

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