欧阳召，王春梅，陶 志

（北京中医药大学中药学院生物制药系，北京 100102）

蛹虫草Cordyceps militaris(L.)Link.，又称北冬虫夏草，为虫草属中的重要一种。经研究证明，蛹虫草中所含有的虫草素具有多种生理活性，如抑菌、抗肿瘤、抑制病毒，以及增强免疫功能、防治心脑血管疾病等功能[1-3]。目前，蛹虫草生产仍以固体栽培收获子实体为主，虫草素也主要靠从蛹虫草子实体中提取获得，然而子实体培养有一定难度，子实体生产周期长，且虫草素从蛹虫草子实体中提取、分离工艺繁琐、复杂，从而大大增加了虫草素的生产成本[1]。蛹虫草液体发酵则具有周期短、活性物质易于提取等优点。对于蛹虫草发酵培养的研究，前期的工作多集中于获得较多的菌丝体[4]，较少报道以提高虫草素含量为目标的培养研究。为了提高蛹虫草液体发酵中虫草素的含量，本文从发酵培养基和发酵培养条件两个方面入手，对蛹虫草液体发酵中虫草素积累的影响因素进行研究，为工业化高效生产虫草素提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

蛹虫草菌种购自中国科学院微生物研究所，菌种编号为5.0700，培养保藏于北京中医药大学中药学院生物制药系。

1.2 培养基

1.2.1 母种培养基

采用PDA综合培养基。

1.2.2 液体发酵优化培养基

在检索文献所得到培养基配方的基础上，设计了以下5种液体发酵培养基配方。

1号：蛋白胨 15 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、磷酸二氢钾1 g·L-1、 七水合硫酸镁 0.5 g·L-1、 VB110 mg·L-1、 萘乙酸2 mg·L-1。

2号：蛋白胨 15 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、磷酸二氢钾1.5 g·L-1、 七水合硫酸镁 0.5 g·L-1、 VB15 mg·L-1、 萘乙酸2 mg·L-1。

3号：蛋白胨 20 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、七水合硫酸镁 0.5 g·L-1、 磷酸二氢钾 1 g·L-1、 萘乙酸 4 mg·L-1。

4号：蔗糖 40 g·L-1、蛋白胨15 g·L-1、七水合硫酸镁0.5 g·L-1、 磷酸二氢钾 0.5 g·L-1、 萘乙酸 4 mg·L-1。

5号： 葡萄糖 20 g·L-1、 马铃薯（煮汁） 200 g·L-1、 磷酸二氢钾 2 g·L-1[5]。

1.3 方法

1.3.1 固体培养方法

按PDA综合培养基配方配制，高压灭菌后制斜面，将保藏的菌种接入新制的培养基中，将接好的菌种置于25℃恒温箱中培养，至洁白的菌丝体长满试管斜面为度。

1.3.2 液体发酵方法

将PDA斜面培养基上经过活化的蛹虫草菌种，接入上述5种液体培养基中进行摇瓶发酵（250 mL摇瓶装100 mL培养基），在25℃、130 r·min-1、光照12 h的条件下培养，进行一级发酵，使菌种适应新环境，在出现大量松散的小米粒样的菌丝球时一级发酵完成。将得到的一级种子定量接入新的培养基中，相同条件下培养15 d（预实验证明第15天时，发酵液中虫草素的含量不再发生明显变化)，得到二级发酵产物。

1.3.3 发酵液中虫草素含量鉴定

对发酵产物进行提取。发酵液12000 r·min-1离心，15 min后取上清，醇沉蒸干后，甲醇洗下得到样品。 虫草素含量鉴定用薄层色谱法[6]（色谱条件：薄层板 GF254硅胶板； 展开剂∶氯仿∶乙酸乙酯∶异丙醇∶水=8∶2∶6∶0.5，每10毫升展开剂加2滴～4滴氨水，虫草素对照品浓度为1 mg·mL-1，定量点样），鉴定各样品中虫草素的含量，根据薄层板上虫草素斑点的大小来鉴别虫草素的含量，从而据此来选择发酵培养基。

1.3.4 液体发酵培养条件的优选

在确定最优发酵培养基后，为确定蛹虫草液体发酵产生虫草素的最优发酵条件，设计了正交实验，见表1、表2。

表1 正交实验因素水平表

表2 L9（33）正交实验安排表

1.3.5 统计学处理

得到的图片以Quantity one软件对显色点进行分析，点光密度曲线下面积为相对含量，计算平均值。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基优选结果

5种发酵培养基分别记作1号到5号，在相同条件下进行发酵，在发酵一定时间后提取并进行薄层鉴别，以虫草素的含量为指标，结果见图1。

由薄层色谱结果可知，1号培养基较适合虫草素积累，重复实验结果相同，故选择其作为发酵培养基。

2.2 发酵培养条件优选结果

用优选好的发酵培养基进行正交实验，在发酵第15天时进行提取操作，薄层色谱法鉴定各发酵条件下发酵液中虫草素的含量，见图2。

图2结果显示，1号～3号有相对较少的虫草素积累；4号～6号有相对较多的虫草素积累，其中5号虫草素含量最高；7号～9号无虫草素积累。由实验结果可知，25℃适合虫草素积累；正交试验优选的最佳条件为pH7，温度25℃，光照12 h。

3 结论与讨论

已经有较多的工作对蛹虫草的培养基和培养条件进行了研究[4，7-9]，但多数研究关注的点是提高虫草菌丝的生长量，而以提高虫草素含量为目标，探讨蛹虫草的培养基及培养条件的研究较少见。通过蛹虫草生产虫草素具有很好的商业前景[1]，因此，本文侧重点在于确定产生较多虫草素的蛹虫草培养基和培养条件。

本研究国内外首次发现，光照对于虫草素的产生至关重要，没有光照虫草素不能产生（图2），可能虫草素的产生与光敏调控系统有关。传统蛹虫草的培养认为菌丝体的生长应该在黑暗中进行[4]，另有研究认为光照抑制菌丝体的生长[9]，本实验室认为无光培养不适合以虫草素的生产为目的的培养。关于光照与虫草素产生的关系，本实验室正在进行深入研究，结果将另文发表。

本实验采用二级液体发酵，进行二级发酵的目的是使斜面菌种适应新的培养基环境，一级发酵在进行到第5天时菌丝球大量产生，生长进入对数期，此时菌种活力最旺盛，接入二级发酵培养液中可进行发酵培养。预实验表明在二级发酵进行到第15天左右时，虫草素积累至一定程度，虫草素含量不再发生明显变化，终止发酵。使用薄层色谱法进行半定量分析，在保证发酵液体积相等、操作提取条件相同、所加甲醇体积相同以及点样量相同等平行操作条件下，可以反映各种发酵液中虫草素的含量，本实验及重复实验证明，1号发酵培养基是适合虫草素积累的优良培养基。在优选的培养基基础上，通过正交实验优选出了适合虫草素积累的液体发酵培养条件，其也较适合虫草素的积累。

由实验结果可得，蛹虫草液体发酵的最优培养基为蛋白胨 15 g·L-1、 葡萄糖 20 g·L-1、 磷酸二氢钾 1 g·L-1、 七水合硫酸镁 0.5 g·L-1、 VB110 mg·L-1、 萘乙酸 2 mg·L-1；蛹虫草液体发酵的最优培养条件为发酵液pH7，培养温度25℃，光照时间12 h。在优选出的培养基和培养条件下发酵液中虫草素积累量较高。本研究的数据对于工业上利用蛹虫草高效生产虫草素，如何选择培养基和确定培养条件提供参考和依据。

[1]杨涛，董彩虹.虫草素的研究开发现状与思考[J].菌物学报，2011，30(2)：37-47.

[2]张平，朱述钧，钱大顺，等.北冬虫夏草功能成分及保健作用分析[J].江苏农业科学，2003(6)：105-107.

[3]李祝，刘爱英，梁宗琦.虫草菌素的生物活性及检测方法[J].食用菌学报，2002，9(1)：57，62.

[4]何洋，刘林德，赵彦宏，等.蛹虫草优化培养研究进展[J].鲁东大学学报：自然科学版，2011，27(1)：64-67.

[5]周洪波，肖升木，阮承超，等.蛹虫草液体的深层发酵[J].中南大学学报：自然科学版，2006，37(6)：1098-1102.

[6]刘静明，刘岱，杨立新，等.蛹虫草菌丝与冬虫夏草中核苷类成分的含量测定[J].中国中药杂志，1994，19 (10)：615-616.

[7]秦秀丽，周淑荣.蛹虫草液体培养基的优化试验研究[J].特产研究，2010 (3)：30-33.

[8]程红艳，郭伟，常明昌，等.蛹虫草菌丝体液体发酵培养条件的优化研究[J].山西农业大学学报：自然科学版，2011，31(1)：66-72.

[9]宋仙妹，常继东.蛹虫草菌丝体培养特性的研究[J].食用菌，2008(3)：12-14.