王 冬

（山西省运城市中心医院，山西 运城 044000）

牙周病一种由微生物引起的感染性疾病，病原微生物可能包括真菌、病毒和细菌等，牙菌斑中的细菌研究作为口腔医学领域的热点，一直在寻找合理的染色法来对细菌值进行计数，使人们在临床应用中掌握更多治疗牙周炎的医学方法。在之前的微生物学研究中常用的细菌染色法有革兰染色，芽孢染色、抗酸染色法等，这些方法操作复杂不易掌握。现临床上现有采用刚果红负染法，作为一种微生物检测方法，口腔微生物的细菌学检查的应用中，可有效的检测牙周病治疗过程中，戴正畸矫正器或修复体时口腔细菌分布变化[1]，判断药效以及治疗方法的临床疗效。很多文献资料表明，刚果红负染法可以有效的计算出螺旋体菌数值。但在龈下菌斑样本中有多种菌类，本院就对龈下菌斑涂片采用了传统的细菌染色法即革兰染色与刚果红负法染对同一样本进行不同染色，旨在研究刚果红负染在细菌总数一定的情况下，对细菌的统计，探讨其他细菌计数的偏差是否会影响到螺旋体的比例，进一步比较两种方法的优缺点，以便在以后的临床上可以选择合理的染色方法，现将研究报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2010年5月至2011年6月，在我院口腔门诊收治的牙周病患者36例，男性14例，女性24例，年龄21～79岁，平均37.5岁，取每位患者不同牙的2个位点，牙周袋深在3.2～7.6mm之间，所有患者无其他口腔内并发症。

1.2 方法

①取样：确定取样的病牙位点，先去除表面的龈上菌斑和牙石，再用一次性探针插入牙周袋底，要沿病牙的牙冠或根面刮取龈下菌斑。将所采集到的菌斑，先置于滴有生理盐水的载玻片上，要进行刚果红负染的标本在涂匀后再放入滴有2%刚果红的载玻片上，将染料均匀涂开，约0.1ml2%刚果红染液涂成直径约1.5～2cm薄厚最为适宜，置空气中自然风干，每个位点要做成至少2张涂片，一张先进行刚果红染液染色后备用，一张只涂有生理盐水备用。②染色：采用刚果红负染法，先在一广口瓶中装入12mol/L的浓硫酸，再将已干燥涂有刚果红的一面盖于广口瓶上，待涂片颜色由红色变成蓝色后，取下待观察。本实验中采用改良后革兰氏染色法，先把生理盐水涂片过火固定，再用结晶紫染液染色1min，水冲洗，然后用革兰氏碘液染色1min，水冲洗，接着再用0.4%复红乙醇液染色30s，水冲洗，最后用吸水纸吸干后待镜检[2]。③计数：先在所有涂片上加上镜油，在把涂片置于显微镜油镜下（15×100）观察，选择细菌分布均匀视野进行分类计数。观察计数5中不同形态的细菌200个，其中螺旋体、球菌、杆菌、弯曲菌、梭状菌。

1.3 统计方法

采用统计软件SPSS10.01进行数据处理，每种菌类采用t值检验，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结 果

龈下菌斑生理盐水涂片经过刚果红负染，再由浓盐酸蒸气熏蒸后，涂片的背景呈现蓝色，由于细菌未被着色，在蓝色背景下就呈白色。龈下菌斑生理盐水涂片经革兰染色后，在光学显微镜油镜下观察见红色菌为革兰阴性菌， 蓝色菌为革兰阳性菌。分别在光学显微镜下计数5种形状的细菌。见表1。

表1 两种染色分类方法的比较

结果显示，两种染色方法所观察到的螺旋体、弯曲菌、梭状菌3 种形态的菌数值P＞0.05，不存在显著性差异，不具有统计学意义，球菌、杆菌两种形态菌数值P＜0.01，存在显著性差异，具有高度统计学意义。

3 讨 论

细菌作为一种无色半透明的微小生物，怎样才能清晰观察到其形态结构一直是微生物研究中重要环节，现实验中多使用显微镜和细菌的染色相结合来清楚地观察细菌的形态结构，故在实验过程中，染色的好坏直接决定能否清楚地观察细菌的结构和形态[3]。传统细菌的染色方法主要革兰染色，芽孢染色、抗酸染色等。本文实验中采取的革兰染色在传统的染色方法基础之上加以改进，同样取得了正确无误的染色结果，颜色突出易识别。在过去的革兰染色法中，一直运用兰氏4步法，虽效果好，但操作过程复杂不易掌握，不适宜初学中使用，三步法原理与四步法相同， 只是把酒精脱色和复染合并成用0.4%复红乙醇液染色一步中进行，因为用酒精脱色，过度脱色会把革兰氏阳性菌染成红色，脱色不够会把革兰氏阴性菌染成阳性菌，现采用是三步法不仅避免了这样的问题，还节约了操作时间。

刚果红作为一种酸性染料，在蒸馏水中以游离形态存在，但一遇到强酸，就会发生沉淀，刚果红染料在pH＜3.0时为蓝色，pH＞5.0时为红色，在一般环境中空气pH＞5.0，故涂片在放置时呈现红色。在放与显微镜观察前，经过浓盐酸蒸汽熏蒸，刚果红由红色变为蓝色，但细菌不着色，呈现白色，故在蓝色的背景下可以清晰观察到白色细菌的形态。实验结果可以看到，对于形状较特殊，菌体较大的螺旋体、弯曲菌、梭状菌两种染色法计数无差异，从本实验得到是数据亦可证明，刚果红负染法因其操作简单，是检测螺旋体的良好方法。在观察过程中，在刚果红负染镜检样本中可以看到较多形态、大小似细菌的颗粒，这些颗粒的大小与油镜下观察的球菌相似，这可能是造成结果中球菌、杆菌两种染色方法差异的原因之一。而采用的革兰染色法，因细菌与革兰染液有特殊的结合，故非细菌颗粒与球菌在着色上存在差异，可以将两者区分开。

革兰染色方法虽步骤多，操作复杂，技术要求高，但能很好的分出但对革兰阳性、阴性菌，在临床上分离致病菌有实际意义，刚果红负染法作为操作方便的检测法，其检测螺旋体可同样可用于监测治疗效果[4]，故在实际应用中，可根据目的选择适宜的染色方法。

[1]寇育荣,潘亚萍,张光和.牙周炎治疗过程中龈下菌斑的动态观察[J].中国微生态学杂志, 1999,11(5): 301.

[2]肖晓蓉.口腔微生物学及实验技术[M]北京:北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社,1993:85.

[3]白毓谦,方善康,高东,等.微生物实验技术[M].济南:山东大学出版社,1986:50-52.

[4]李德懿.牙周病微生物学[M].天津:科技翻译出版公司,1994:77.