胡丽荣，王景春，肖 倩，李金明，杨 峰，王福海

(1河北联合大学附属医院，河北唐山 063000;2唐山市丰润区人民医院)

视神经损伤是常见的眼外伤，常致患者视力部分或完全丧失，目前缺乏有效的治疗措施。视神经损伤后的修复是近年来国内外学着较为关注的问题。大量实验证明，一氧化氮(NO)在诱导神经退行型变过程中发挥着重要作用。生物体内的NO是以左旋精氨酸和分子氧为底物，在一氧化氮合成酶(NOS)的作用下生成瓜氨酸并释放出NO。氨基胍(AG)是NOS的相对特异性抑制剂。2011年7～8月，我们观察了AG对兔受损视神经的保护作用，旨在为临床视神经损伤的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 健康大白兔44只，由我院动物实验中心提供，雌雄不限，体质量2.0～2.5 kg。眼结膜无明显充血水肿，角膜透明，瞳孔等大等圆，对光反射灵敏。实验性饲养3 d后，随机分为对照组4只、损伤组和治疗组各20只。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备及干预 损伤组及治疗组制作视神经损伤模型:用浓度1 g/L的乌拉坦，剂量5 mg/kg，兔耳缘静脉注射麻醉后，将兔俯卧固定于专用的兔台上，手术显微镜下剪开外眦5 mm，缝线开睑，于颞上方角膜缘处剪开球结膜，在上直肌、外直肌的肌止端做牵引缝线，将眼球牵向鼻下方，钝性向球后分离，暴露视神经，用中号显微血管夹(上海医疗器械公司生产，夹持力98 g)，在球后3 mm处夹持视神经20 s，制成视神经损伤模型［1］。经检查，兔眼球无明显突出，眼睑闭合完全，术眼瞳孔散大，直接光反射迟钝或消失，眼底检查无视网膜出血及血管梗塞。用妥布霉素冲洗术野，缝合球结膜及外眦，术眼滴氯霉素眼药水，涂红霉素眼药膏。对照组不作任何处理，治疗组于造模后24 h内给予AG 100 mg/kg，腹腔内注射，2次/d;损伤组予等量盐水10 mL/kg，2次/d。

1.2.2 视网膜NO浓度及凋亡细胞检测 造模后第1、3、7、14、21 天选取兔 4 只(8 只眼)击头处死，迅速摘取眼球，去除眼前节，在显微镜下剥离视网膜。其中6只眼用硝酸还原酶法检测视网膜NO浓度(用硝酸还原酶特异性的将NO－3还原为NO－2，再通过其显色深浅推算出NO的浓度)。具体操作及结果计算按NO试剂盒说明书进行。治疗组及损伤组取另2只眼用4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，行凋亡细胞原位缺口末端标记法(TUNEL)染色，操作按试剂盒说明书进行，镜下观察计数凋亡细胞数及TUNEL染色阳性细胞数。典型的阳性(凋亡)细胞为细胞皱缩，核固缩或破裂，着色深呈棕黄或黄褐色，核边或可见凋亡小体。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，应用方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组视网膜NO浓度 见图1。由图1可见，损伤组和治疗组造模后第 1、3、7、14、21 天视网膜NO浓度均明显高于对照组，治疗组均明显低于损伤组，P均 ＜0.05。

2.2 各组视网膜凋亡细胞数比较 见图2。由图2可见，损伤组和治疗组造模后第 1、3、7、14、21 天视网膜凋亡细胞数均明显高于对照组，治疗组均明显低于损伤组，P 均 ＜0.05。

图1 三组NO浓度比较

图2 三组凋亡细胞数比较

3 讨论

临床上常见的视神经损伤多为瞬间外力造成的间接非横断性损伤，可发生在任何部位，多为视神经纤维的挫伤，伤后常伴视力立即下降或迟发减退至丧失。本研究视神经损伤模型造成视神经纤维的部分挫伤，无横断，类似于临床上最常见的视神经损伤，在整个操作过程中致伤部位、力度和时间一致，可制作稳定的视神经损伤模型，且具有操作简便、可控性及重复性等优点。

NO是一种无机小分子气体，在机体内广泛存在，易弥散通过细胞膜。生物体内NO的作用有双面性，一方面其作为一种神经递质和免疫活性物质，产生多种生物学效应;另一方面，过量的NO对机体具有毒性作用，参与神经系统的多种病理损伤过程，可介导神经元及胶质细胞的凋亡［2，3］。体内的NO在NOS的作用下生成，现已确认的NOS有三种亚型，即神经元型、内皮细胞型、诱导型(iNOS)。研究表明，iNOS是一种仅在病理状态下才会表达的非钙离子依赖性酶，主要在视网膜受创伤、缺血、感染等因素诱导下产生，参与机体的病理生理过程。本研究损伤组和治疗组造模后第1、3、7、14、21天视网膜NO浓度均明显高于对照组，治疗组均明显低于损伤组，说明NO在视神经损害过程中发挥作用。由于iNOS RNA半衰期特别长，可持续长时间翻译合成iNOS，产生NO的量较大，对视网膜的损伤也特别大［4］，因此研制高选择性、高效、低毒的 iNOS抑制剂尤为重要。

AG为无毒小分子物质，是一类具有亲核作用的肼化物。Corbett等于1992年首次报道其具有高选择性抑制iNOS的作用，是近年研究较多的iNOS抑制剂。本研究发现，损伤组和治疗组造模后第1、3、7、14、21天视网膜凋亡细胞数均明显高于对照组，治疗组均明显低于损伤组，说明AG对受损的视神经有保护作用。AG对视神经损伤后RGCs保护性作用机制主要有:①与iNOS催化部位的血红素铁可逆性结合，从而改变其活性基团的构象［5］，而使iNOS失活，因为AG也以这种方式失活其他含铁或含铜酶。Bryk等从分子机制角度研究了AG的作用原理，发现AG通过在活性位点与血红素残基共价结合，并将被修饰的亚铁血红素残基以共价键结合于蛋白的活性位点而对iNOS起抑制作用。②AG除在蛋白质水平对iNOS起明显抑制作用外，还可明显抑制iNOS mRNA的表达，这与Kobayashi等［6］研究结果相似。③AG酰肼集团与不同的内源性羟基代谢产物和潜在有害的醛结合［7］。AG可通过抑制iNOS表达进而抑制NO的释放［8］，并对iNOS的抑制作用具有持续性，对周围神经系统的神经有保护性作用。④AG可以产生大量自杀产物来抑制iNOS。与非选择性iNOS抑制剂比较，AG在抑制iNOS病理性表达的同时，很大程度上保留了构成型NOS 的生理功能［9］。Arthur等［10］报道，在视网膜缺血和再灌注损伤的动物模型中给予AG，神经保护作用明显好于未给药组，而且AG对心、脑、肾及血压的影响很小，对眼压无任何影响。

总之，AG是目前发现的一种高选择性，高效，低毒的iNOS抑制剂，对受损神经有保护性作用。本研究结果为临床视神经损伤的治疗提供了新的思路。

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