王德国，王 新，刘 玉，王 星，邢 文，李祥东，杨 胜，王安才，孙贤林

(1.皖南医学院附属弋矶山医院老年心血管科，安徽芜湖 241001;2.安徽省立医院心脏科，安徽合肥 230001)

心肌细胞间缝隙连接(gap junction，GJ)是电冲动的快速传导通路，主要分布在心肌细胞端－端连接处。当心肌缺血时，Cx43表达降低、向心肌细胞侧边分布，严重影响电传导，是心律失常发生的主要机制之一［1］。最近，Shaw 等［2］发现微管系统是细胞Cx43快速运输并装配到闰盘部位的结构基础，在心肌缺血或者氧化应激时，导致Cx43在细胞侧边分布和无序分布，细胞间电传导相应减慢［3］。Taxol作为一种微管稳定剂，可促进缺氧状态下微管的聚合［4－5］。本实验旨在观察微管稳定剂Taxol是否参与心肌缺血损伤的导致的Cx43重构，探讨稳定剂Taxol能否作为新的抗心律失常药物。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 AnaeroPack安宁包厌氧培养袋中(日本三菱公司)，Langendorff灌注装置(南京美易科技有限公司)，电泳槽及电泳仪(美国BIORAD公司)，共聚焦显微镜(德国Zeiss);Taxol购自于Sigma公司，兔抗鼠Cx43抗体(Abcam公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 将分离的大鼠心肌细胞随机分为8组，以台盼蓝染色法测定细胞存活率。(1)对照组:细胞静置120 min;(2)缺氧组:心肌细胞低氧120 min;(3)Taxol干预组:在缺氧前给予不同浓度的 Taxol(0.1、1 、10、100、1、10 nmol·L－1)，其余同缺氧组。

1.2.2 用酶解法分离大鼠心室肌细胞［6］大鼠断颈处死后取出心脏，4℃氧饱和Tyrode液洗净血液，Langendorff恒流灌流(37℃)，流速10 ml·min－1，并以纯O2饱和。无钙Tyrode液灌流5 min后再以I型胶原酶0.3 g·L－1的无钙 Tyrode液灌流消化10 min。随之将心室肌剪碎，于含0.1%BSA的无钙Tyrode液中37℃孵育15 min，细胞悬液用200 μm的尼龙网过滤，滤液在无钙Tyrode液中逐步复钙至Ca2+浓度为1.25 mmol·L－1。无钙 Tyrode液成分(mmol·L－1):NaCl 100.0，KCl 10.0，KH2PO41.2，MgSO45.0，葡萄糖20.0，牛磺酸10.0，MOPS 10.0(pH 7.4)。

Tab 1Effects of microtubule stabilizer(Taxol)on cell viability exposed to hypoxic condition(±s，n=8)

Tab 1Effects of microtubule stabilizer(Taxol)on cell viability exposed to hypoxic condition(±s，n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group;#P＜0.05 and##P ＜0.01 vs hypoxic group(0 nmol·L－1Taxol)

－1 0.1 1 10 100 1000 10000 Rod cells numbers 123±23 35±11＊＊ 45±14＊＊ 66±21＊＊## 84±26＊＊## 53±22＊＊# 42±12＊＊ 37±11 Control Taxol/nmol·L 0＊＊Cell viability(%)78±12 23±11＊＊ 34±12＊＊ 42±12＊＊## 53±13＊＊## 38±9＊＊## 35±10＊＊# 28±11＊＊

1.2.3 心肌细胞低氧模型 取分离的心肌细胞悬液1 ml，加入到16孔培养板中，按实验设计将缺氧及干预组细胞放到AnaeroPack安宁包厌氧培养袋中，其中的氧清除剂能迅速将O2通过转换为CO2，从而使氧浓度降低到1%以下，氧指示剂由蓝色变为无色［7］。厌氧静置120 min作为缺氧模型。缺氧120 min后，在倒置显微镜下观察每个高倍视野下的杆状心肌细胞数目。

1.2.4 心肌细胞存活率的测定 吸取各组心肌细胞悬液到96孔培养板，以0.4%台盼蓝排斥反应来判断心肌细胞存活率，死亡的细胞呈蓝色，存活的细胞则不着色，在显微镜下每个样品记数400个心肌细胞，计算细胞存活率。同时在显微镜下观察每个高倍视野下的杆状心肌细胞数目［6］。

1.2.5 免疫荧光染色检测单个心肌细胞Cx43分布［7］吸取少量心肌细胞滴到载玻片上，加入4%多聚甲醛固定5 min，热风吹干，PBS液轻洗细胞3次，滴加10%山羊血清封闭非特异性抗原(30 min)，滴加1∶200抗Cx43单克隆抗体，4℃过夜，PBS洗后滴加TRTC标记的抗兔抗鼠二抗，37℃ 30 min，DAPI染核5 min，PBS洗后封片，激光共聚焦显微镜观察切片。

1.2.6 Western blot检测心肌细胞 Cx43蛋白表达［7］将各组心肌细胞离心、裂解、离心以提取总蛋白质。采用12%分离胶及5%浓缩胶进行SDSPAGE电泳。PVDF膜和凝胶在冰浴条件下60 mA恒流电转1 h。将PVDF膜在1%BSA 4℃封闭过夜。加入一抗工作液(1∶1 000)，37℃孵育1 h。加入HRP标记的二抗工作液(1∶2 000)，37℃孵育1 h。加入TCL发光液显色、曝光、扫描保存。Image J图像分析软件定量分析Cx43表达。

2 结果

2.1 微管稳定剂对缺氧心肌细胞存活的影响 缺氧时心肌细胞明显受损，细胞存活率明显降低，镜下计数示杆状心肌细胞数目明显减少(P＜0.01)。Taxol在0.1～10 nmol·L－1浓度下成剂量依赖性地提高杆状细胞数，提高心肌细胞存活率，而100 nmol·L－1～10 μmol·L－1浓度下杆状细胞数开始减少，细胞存活率明显降低(P＜0.01)。

2.2 微管稳定剂对缺氧心肌细胞Cx43蛋白表达的影响 如Fig 1所示，缺氧条件下，心肌细胞Cx43蛋白表达下降，0.1～10 nmol·L－1浓度范围内的Taxol呈剂量依赖性地改善心肌细胞的Cx43表达，但 100 nmol·L－1～ 10 μmol·L－1的浓度范围内的Taxol则抑制心肌Cx43。

Fig 1 Effects of microtubule stabilizer(Taxol)on Cx43 expression of cardiac myocytes exposed to hypoxic condition.(±s，n=8)

2.3 微管稳定剂对缺血心肌细胞Cx43分布的影响 如Fig 2所示，非缺氧组心室肌细胞Cx43(红色)主要分布在心肌细胞的两端的闰盘处(A)，当心肌细胞缺氧120 min，细胞侧边出现Cx43分布(B)。0.1～10 nmol·L－1浓度范围内的Taxol呈剂量依赖性地抑制侧边 Cx43(C、D、E)，100 nmol·L～1－10 μmol·L－1的浓度范围内(F、G、H)，心肌细胞两端Cx43也明显受到抑制。

3 讨论

缺血导致心肌细胞骨架结构及功能障碍，微管是细胞骨架的重要组成部分，影响心肌细胞蛋白的转运和功能。Taxol作为一种微管稳定剂，主要位点是微管蛋白/微管系统，它能促进微管聚合，抑制微管解聚［8－9］。本研究以离体心肌细胞缺氧模型，观察电传导重要离子通道Cx43在缺氧下的表达与分布情况，并以不同剂量的微管稳定剂干预，观察其细胞毒性及对Cx43的稳定作用。

本研究发现，低剂量的Taxol可明显减轻缺氧所致的心肌细胞死亡，维持细胞的杆状结构。有研究显示Taxol可明显维持缺氧条件下的心肌Ca2+-ATPase活性，并减轻心肌细胞内的钙离子浓度［10］。对钙稳态的保护作用可能是Taxol降低细胞死亡的原因之一。然而，本研究也发现大剂量的Taxol明显增加缺氧心肌细胞的坏死和挛缩。但具体毒性机制不甚清楚，可能与大剂量的Taxol抑制了心肌细胞的能量代谢及信号蛋白的转运有关。

Cx43组成的心肌细胞间缝隙连接是快速电传递通道，在心律失常产生机制中具有重要作用。心肌缺血时，心肌细胞的Cx43分布紊乱，表达量降低，心肌闰盘连接处的Cx43分布减少，而细胞质及心肌细胞的侧边(非闰盘区域)Cx43分布增加。最终导致心肌细胞见电传导延缓，从而参与折返性心律失常的发病机制［7］。迄今为止Cx43重新分布的原因并不完全清楚。最近研究显示微管正端结合蛋白(EB1)促进微管稳定，引导Cx43定向转运到细胞膜，并组装成缝隙连接，从而形成心肌细胞间的快速电连接［2］。心肌应激状态下，Cx43不能定向运输到细胞连接处形成缝隙连接，去除应激或使用抗氧化应激均可降低Cx43和EB1向胞质内分布。同样，EB1表达抑制同样造成Cx43不能正确的定向装配。适时荧光共聚焦显微镜可清楚观察到EB1向胞质的转运与Cx43侧化、微管紊乱同步改变［3］。

本研究显示低剂量Taxol呈剂量依赖性地减轻心肌细胞缺氧所致的Cx43表达抑制，形态学观察可见Taxol可明显抑制缺氧所致的Cx43侧边分布。这提示微管稳定性参与缺氧条件下Cx43的重新分布，对缺血性心律失常具有潜在影响［10］。由于缝隙连接重构在缺血性心脏病心律失常机制中扮演很关键角色，因此低剂量的Taxol有可能具有抗心律失常作用。另外，本研究也观察到大剂量的Taxol则明显抑制心肌Cx43表达，并进一步抑制细胞闰盘处的Cx43分布，其机制可能是抑制了Cx43的蛋白合成。

Fig 2 Effects of microtubule stabilizer(Taxol)on Cx43 distribution of cardiac myocytes exposed to hypoxic

综上所述，低剂量Taxol可减轻缺氧所致的心肌细胞损伤，维持细胞的杆状结构，同时稳定Cx43在心肌闰盘处的分布，具有潜在的抗心律失常作用。但大剂量Taxol具有明显的细胞毒性，在进行整体实验中需要控制用量和速度。

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