刘 丹，尹 东，曾 姝，何 明

(1.南昌大学医学院药理学教研室，2.江西省分子医学重点实验室，江西 南昌 330006)

四甲基吡嗪(TMPZ)又名川芎嗪，是从川芎的生物碱中分离得到的有效单体。川芎嗪有良好的心肌保护作用，主要与其具备抗钙与抗自由基双重作用有关［1－2］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)为革兰阴性细菌胞壁的重要成分，是引起炎症反应和休克的关键介质之一，常引起全身炎症反应并可导致多器官功能衰竭，累及心脏。有研究报道［3］，LPS可增加心肌细胞NADH氧化酶的表达及过氧化物增殖而导致心肌损伤。鉴于川芎嗪的抗氧自由基作用，我们假设川芎嗪可以保护LPS损伤的心肌细胞，目前尚未见报道。因此，本研究利用LPS诱导心肌细胞损伤，观察川芎嗪对LPS诱导的心肌细胞损伤的影响，并检测活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成、细胞的氧化应激状态及NF-κB p65的核移位情况，探讨川芎嗪对抗LPS损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 受试药品与主要试剂 TMPZ:中国药品生物制品检定所，NF-κB p65、β-actin抗体及相应二抗:Santa Cruz;DCHF-DA:Molecular probes;胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司;MDA、SOD、GSH-Px检测试剂盒:南京建成生物工程研究所;胞核-胞质蛋白制备试剂盒:北京普利莱基因技术有限公司;MEM培养基:Gibco BRL;LPS(伤寒菌内毒素脂多糖)、胰酶、HEPES、MTT、增强化学发光印迹试剂、硝酸纤维素膜(Amersham，UK)、丙烯酰胺、PMSF、亮肽素、SDS、亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、EDTA和DTT:Sigma公司;其它试剂均为分析纯。

1.2 心肌细胞的分离培养 参照以前的实验方法［4］，以出生1～3 d的SD乳鼠心室肌组织为实验对象，0.1%胰酶消化分离，MEM培养基(含15%胎牛血清)混悬后放CO2培养箱(5%CO2，37℃)孵育2 h去除成纤维细胞，然后分别按5×105cells·well－1、1 ×105cells·well－1接种于 6 孔、96 孔培养板，隔天换培养液，前3 d加入0.1 mmol·L－1Brdu抑制纤维细胞生长。培养4 d随机分组进行实验。

1.3 药物处理 用不同剂量的TMPZ预处理3 h，弃原培养基，用PBS清洗3次，换新的MEM培养基，再加LPS(5mg·L－1)继续培养6 h，收集细胞进行实验。每次实验均分溶剂对照组(正常对照)、LPS处理组及药物干预组(TMPZ+LPS)，每组至少重复6次，TMPZ用生理盐水溶解。

1.4 细胞存活率 MTT比色法检测细胞存活率。胰酶消化收集细胞，每组细胞以1×104cells·well－1浓度接种至96孔培养板中。细胞融合至80%左右开始检测。吸弃原培养基，每孔加入20 μl MTT 溶液(5 g·L－1溶于PBS)，37 ℃，4 h，然后每孔加DMSO 150 μl振荡10 min，使蓝色结晶充分溶解，在490 nm波长处测定其光吸收值(OD值)。

1.5 生化检测 各组处理结束后取上清200 μl，生化自动分析仪检测LDH活性。

1.6 流式细胞法检测心肌细胞内ROS含量 实验结束后，用4℃预冷的PBS洗涤细胞2～3次，加入0.25%胰蛋白酶 (含0.02%EDTA)消化细胞后收集，将配制好的 10 μmol·L－1DCFH-DA 溶液 500 μl重悬细胞，37℃孵育30 min，离心，800 ×g，5 min，弃上清，预冷的PBS洗涤细胞2～3次，制成1×108cells·L－1的悬液，立即进行流式细胞仪检测，以488 nm为激发波长，530 nm为发射波长。以不加DCFH-DA的一管为阴性对照。

1.7 细胞内丙二醛(MDA)含量、SOD及GSH-Px活性测定 实验结束后，消化收集心肌细胞，反复冻融破碎细胞，离心后取上清液，按试剂盒说明书进行操作。

1.8 Western blot检测 实验结束后，按试剂盒说明书提取心肌细胞核蛋白，同等量蛋白质行SDSPAGE后，电转膜，分别结合一抗、二抗，最后X线胶片曝光分析。

1.9 数据处理 应用SPSS11.5统计软件行组间方差分析，各实验组数据以±s表示。

2 结果

2.1 TMPZ对LPS致心肌细胞损伤的影响 如Fig 1，2 所示，心肌细胞用不同剂量(40、80、120 μmol·L－1)TMPZ 预处理 3 h，加入 10 mg·L－1LPS，心肌细胞的存活率随TMPZ剂量的增大而升高，LDH值则随TMPZ剂量的增大而减少，具有明显的剂量依赖性。

Fig 1 Effects of TMPZ on viability of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6)

Fig 2 Effects of TMPZ on LDH activity of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6)

2.2 TMPZ剂量依赖性地减少ROS生成 流式细胞仪检测结果显示(Fig 3)，用10 mg·L－1LPS处理培养的心肌细胞，ROS生成明显增加(与对照组比，P ＜0.01)，用40 ～120 μmol·L－1TMPZ 预处理心肌细胞3 h，从 40 μmol·L－1TMPZ 开始，ROS 生成明显降低(与LPS处理组相比，P＜0.01)。说明随着药物浓度的增加，ROS的生成逐渐减少。

2.3 TMPZ剂量依赖性地抑制NF-κB p65核移位

Western blot结果显示(Fig 4)，用10 mg·L－1LPS处理培养的心肌细胞，核蛋白中NF-κB p65蛋白含量明显增加(与对照组比，P＜0.01)，用40～120 μmol·L－1TMPZ 预处理心肌细胞3 h，从40 μmol·L－1TMPZ开始，核蛋白中NF-κB p65蛋白含量明显降低(与LPS处理组相比，P＜0.01)。说明随着药物浓度的增加，抑制NF-κB p65蛋白向细胞核的转移。

2.4 TMPZ剂量依赖性地抑制脂质过氧化，提高抗氧化酶活性 如Fig 5所示，用10 mg·L－1LPS处理培养的心肌细胞，MDA含量明显增加，SOD及GSH-Px活性下降(与对照组比，P＜0.01)，用40～120 μmol·L－1TMPZ 预处理心肌细胞 3 h，从 40 μmol·L－1TMPZ开始，MDA 含量开始下降，SOD 及GSH-Px活性增加(与LPS处理组相比，P＜0.01)。说明随着药物浓度的增加，脂质过氧化被抑制，抗氧化酶活性增加。

3 讨论

LPS是革兰阴性细菌致病的主要因素，它可引起机体的一系列炎症反应，是一种重要的致炎因子［5］。根据文献报告［3，6］，LPS可增加心肌细胞NADH氧化酶的表达及过氧化物增殖，造成ROS生成增加。ROS具有较高的反应活性，正常情况下，细胞存在抗氧化酶类，包括SOD、GSH-Px等，能够清除细胞代谢过程中不断产生的ROS，使得细胞内ROS的生成与清除处于一个相对稳定的水平。但当其生成较多，超过细胞抗氧化酶类的清除水平时，会造成细胞的广泛损伤，如膜脂质过氧化、蛋白质及核酸损伤等。因此，刺激心肌细胞产生过多的ROS可能是LPS诱导心肌细胞损伤的机制之一。我们的研究证实，LPS处理心肌细胞后，会使得MDA含量升高，SOD、GSH-Px活性下降，ROS含量增加，心肌细胞存活率减少。

Fig 3Effects of TMPZ on ROS production of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6).

Fig 4 Effects of TMPZ on nuclear NF-κB p65 protein of cardiac cells subjected to LPS-induced injury by Western blot(±s，n=6)

TMPZ是中药川芎的主要有效成份之一，许多研究［7－8］均报道川芎嗪有心血管保护作用，并且这种保护作用与其抗氧化作用有关。我们在LPS损伤心肌细胞之前给予不同剂量的TMPZ预处理，发现有明显的保护作用，且这种保护作用呈剂量依赖性;进一步对TMPZ抗LPS损伤的机制进行研究，发现与抑制 NF-κB 激活有关。众所周知［9］，NF-κB 信号传导通路被认为是LPS所介导的信号传导通路中最重要的下游通路。一般情况下，NF-κB为p50/p65异源二聚体，与抑制物IκBα结合成无活性的三聚体存在于细胞质中;一旦受到外界因素刺激时，如大量产生的 ROS，IκBα 磷酸化而迅速降解，NF-κB即被激活，p65由细胞质移位至细胞核，从而调控一系列基因表达［10］。在LPS诱导的心肌细胞损伤中，NF-κB的激活很有可能引起大量炎症因子如TNF-α、IL-1等的过度表达，从而造成细胞损伤。我们的实验结果表明，LPS能促进p65的核移位，使p65在核中的表达明显升高，而TMPZ则呈剂量依赖性抑制p65的核移位，从而起到对抗LPS致心肌细胞损伤的作用。因此，可以推断川芎嗪对LPS所致的心肌损伤有保护作用，其机制主要是通过减少ROS生成，从而抑制NF-κB的活化，阻止p65的核移位，减少炎症因子的表达，发挥心肌保护作用。

Fig 5 Effects of TMPZ on content of MDA，SOD and GSH-Px activities of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6)

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