吴 强，何惠燕，傅艳妮，刘 玲，曹铭辉

(中山大学孙逸仙纪念医院1.麻醉科、2.消毒供应中心，广东广州 510120)

吗啡依赖的机制非常复杂，关联到许多调控因素，其中谷氨酸能神经递质系统发挥了重要作用［1］。细胞外液缺乏谷氨酸(glutamate，Glu)失活的水解酶系统，神经末梢释放的谷氨酸需要神经元和胶质细胞上的谷氨酸转运体重摄取至胞内，从而消除谷氨酸能的信号传递作用。兴奋性氨基酸转运蛋白3(excitatory amino-acid transporter 3，EAAT3)是神经元特异性的，在调控Glu摄取速度及Glu受体的功能、调节γ-氨基丁酸(GABA)的浓度、保护神经元方面均发挥重要作用［2－3］。我们前期的研究发现吗啡精神依赖及复吸大鼠前额叶皮层EAAT3蛋白表达水平下降［4］，但其机制未明。本研究使用C6细胞体外模拟吗啡成瘾、戒断、复吸过程，探讨吗啡暴露对C6细胞EAAT3蛋白表达水平的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料试剂 大鼠C6胶质瘤细胞株(购于中山大学动物中心);盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药公司，批号:000355);多克隆兔抗EAAT3(Alpha Diagnostic International，USA);β-actin 抗体(Amersham，Sweden);HRP标记山羊抗兔IgG二抗(Amersham，Sweden);HRP标记的羊抗小鼠二抗(Amersham，Sweden)。

1.2 细胞培养 使用含10%新生牛血清和100 KU·L－1青－链霉素的DMEM培养液培养C6细胞，置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱中培养。分组后，分别按每孔2 ml、108个·L－1细胞浓度，种于6孔板上。分别加入不同浓度的吗啡处理细胞，使得C6细胞在提取蛋白前，细胞间有80% ～100%融合。

1.3 实验步骤 ① 培养好的C6细胞分为5组:Control、0.01、0.1、1 、10 μmol·L－1组，分别使用0、0.01、0.1、1、10 μmol·L－1吗啡作用48 h，Western blot检测EAAT3蛋白表达水平，选择对EAAT3蛋白表达影响最明显的浓度用于下一步的细胞复吸模型。② 将 C6细胞分为 4组:Control、24、48、96 h组，各组吗啡作用时间分别为0、24、48、96 h，作用浓度为步骤①选择的吗啡最佳暴露浓度，Western blot检测EAAT3蛋白表达水平，选择对EAAT3蛋白表达影响最明显的暴露时间用于下一步的复吸模型。③ 将 C6细胞分为6组:Control、Mor 48 h、Ex 3 h、Ex 6 h、Ex 12 h、Ex 24 h组。使用步骤①和步骤②选择的最佳暴露浓度和最佳暴露时间处理细胞，然后用不含吗啡的培养液培养细胞模拟吗啡戒断过程。具体用药如下:Control组为不加药物组，Mor 48 h 组为 10 μmol·L－1吗啡作用 48 h，Ex 3 h、Ex 6 h、Ex 12 h、Ex 24 h 组分别为 10 μmol·L－1吗啡作用48 h 后停药3、6、12、24 h。Western blot检测 EAAT3蛋白表达水平，选择最佳戒断时间用于下一步的复吸模型。④ 将细胞分为6组:Control、Mor 48 h、Ex 12 h、Re 2、Re 4、Re 8 h 组。C6 细胞依次经过吗啡暴露、戒断、再次暴露(吗啡剂量为第1次给药的1/2)，Western blot检测吗啡多次暴露对EAAT3蛋白表达变化的影响，模拟吗啡复吸过程。具体用药如下:Control组为不加药物;Mor 48 h组 10 μmol·L－1吗啡，作用时间为 48 h;Ex12 h 组为 10 μmol·L－1吗啡预处理48 h 停药12 h;Re 2、Re 4、Re 8 h 组分别为 10 μmol·L－1吗啡预处理 48 h、停药12 h 后复处理2、4、8 h。⑤ 将细胞分为4组:Control、Mor(吗啡)、NAL(纳洛酮)、NAL+Mor(纳洛酮加吗啡)组。Control组为不加药组，Mor组为 10 μmol·L－1吗啡预处理 48 h、、停药12 h 后5 μmol·L－1吗啡复处理4 h，NAL+Mor组在吗啡再次暴露前15min使用非选择性阿片受体阻滞剂纳洛酮(1 μmol·L－1)，其余处理同Mor组。NAL组只使用纳洛酮(1μmol·L－1)。观察在吗啡重新暴露前15min使用纳洛酮对EAAT3蛋白表达变化的影响。

1.4 Western blot步骤 用冰冷的PBS洗细胞3次，加适量细胞裂解液裂解细胞，用细胞刮匙将细胞刮下来，超声破碎细胞。混匀细胞5s。细胞液于4℃以12 000×g速度离心30 min，转移上清液于新的EP管中。BCA法测定样品的蛋白含量，用10%SDS－聚丙酰胺凝胶分离蛋白，30 μg/well样品蛋白100 V电泳90 min。然后将蛋白转移到NC膜，转膜电压为100 V，时间1 h。5% 的脱脂奶粉溶液于封闭1 h，多克隆兔抗EAAT3(1∶2 000)4℃孵育过夜，TBST缓冲液冲洗3次，辣根过氧化物酶标二抗，室温孵育1 h，TBST缓冲液冲洗3次，ECL曝光，高敏感X线片显色。用program Image J(version 1.35)进行相对灰度值分析。

2 结果

2.1 不同浓度吗啡作用于C6细胞48 h对C6细胞EAAT3蛋白水平的影响 0.01、0.1、1、10 μmol

·L－1吗啡分别作用于C6细胞48 h，Western blot结果示 10 μmol·L－1组 C6 细胞 EAAT3 蛋白表达明显较对Control组减少(P＜0.05)，见Fig 1。

Fig 1 Effects of different concentrations of morphine on the expression of EAAT3 in C6 cells(n=4)

2.2 10 μmol·L-1吗啡作用不同时间对C6细胞EAAT3蛋白表达水平的影响 10 μmol·L－1吗啡分别作用于C6细胞24、48、96 h后，免疫印迹法检测结果显示作用时间为48、96 h时EAAT3蛋白表达水平较Control组均明显减少(P＜0.05)，见Fig 2。

Fig 2 Effects of 10 μmol·L-1morphine with different action time on the expression of EAAT3 in C6 cells(n=4)

2.3 吗啡作用于C6细胞诱导EAAT3蛋白表达下调后停药不同时间EAAT3表达回升的时间依赖性10 μmol·L－1吗啡作用于 C6 细胞48 h 后 EAAT3蛋白表达较 Control组明显减少(P＜0.05)，停药12、24 h时 EAAT3蛋白表达水平较吗啡作用48 h组明显增加(P＜0.05)，与Control组相比差异无统计学意义(P＞0.05)，见Fig 3。

2.4 吗啡预处理C6细胞停药后、复处理C6细胞不同时间EAAT3表达改变的时间依赖性 10 μmol·L－1吗啡预处理 C6 细胞48 h、及复处理2、4、8 h EAAT3蛋白表达均减少，其中复处理4、8 h时较Control组明显减少(P＜0.05)，见 Fig 4。

2.5 纳洛酮对慢性吗啡暴露戒断后重新暴露C6细胞EAAT3蛋白表达的影响 C6细胞依次经过慢性吗啡暴露48 h、戒断12 h、重新暴露4 h后EAAT3蛋白表达较Control组明显下降(P＜0.05);在吗啡重新暴露前15 min使用非选择性阿片受体阻滞剂纳洛酮(1 μmol·L－1)与吗啡共同作用4 h后可明显抑制吗啡重新暴露引起的EAAT3表达下降(P＜0.05)。与Control组相比，仅使用非选择性阿片受体阻滞剂纳洛酮对EAAT3蛋白表达水平无明显影响(P＞0.05)，见Fig 5。

Fig 3 Effects of different extinction time after 10 μmol·L-1 morphine treated for 48 h on the expression of EAAT3 in C6 cells(n=4)

Fig 4 Effects of retreatment for different time after 10 μmol·L-1 morphine pretreated on the expression of EAAT3 in C6 cells(n=4)

3 讨论

C6胶质瘤细胞可内生性地表达EAAT3和多种阿片受体［5－6］，常被用作研究EAAT3表达水平调控机制的工具细胞。本研究使用C6细胞依次经过吗啡暴露、停药、小剂量吗啡再次暴露的过程，模拟吗啡成瘾、戒断、复吸的行为，探讨EAAT3蛋白表达水平改变参与吗啡成瘾及复吸的可能机制。我们的结果发现，10 μmol·L－1吗啡首次暴露48 h 可明显下调C6细胞EAAT3蛋白表达，至少停用吗啡12 h EAAT3蛋白表达回升至正常水平，C6细胞再次暴露于5 μmol·L－1吗啡作用4 h即可引起 EAAT3蛋白表达明显减少。本研究提示C6细胞EAAT3蛋白表达水平在吗啡暴露后呈时间依赖性变化，而且二次吗啡暴露时EAAT3蛋白表达下降所需吗啡剂量减少、暴露时间缩短。

Fig 5 Effects of naloxone on the expression of EAAT3 in C6 cells treated by chronic morphine exposure，abstinence and reexposure(n=4)

CPP建立－消退－复燃模型是目前常用的研究药物复吸的动物模型［7］。一般 5 ～10 mg·kg－1吗啡腹腔注射训练7－10 d可建立CPP模型，标志药物精神依赖的形成。而CPP已消退的实验动物只需2.5 mg·kg－1吗啡腹腔注射，15 min后进行行为学测试CPP即可复燃［8］。本研究使用C6细胞二次吗啡暴露时吗啡剂量减小、暴露时间明显缩短，与动物成瘾复吸模型的吗啡暴露条件一致。同时我们还发现C6细胞EAAT3的蛋白表达水平在吗啡二次暴露后仍呈现明显的时间依赖性改变，提示吗啡反复使用引起的成瘾或复吸可明显下调EAAT3的蛋白表达，暴露次数越多，EAAT3的蛋白表达下调的速度越快。这说明其蛋白表达水平改变可能是吗啡反复使用而导致成瘾后复吸的重要机制之一。

EAAT3是神经元上主要的氨基酸转运体，其表达水平降低必然影响其清除突触间隙兴奋性氨基酸的功能。大量的实验证明吗啡耐受及依赖后谷氨酸失衡，如海洛因诱发的复吸模型中发现伏核核心部Glu的含量增加。同时研究表明，中枢神经系统Glu递质系统及其受体的激活可以通过增加NAc的多巴胺(DA)释放强化中枢兴奋剂等药物的奖赏效应，促进药物滥用，而阻断内源性Glu的分泌可抑制吗啡诱导的腹侧被盖区中DA释放的增加、拮抗吗啡的奖赏效应，抑制吗啡CPP的形成［9］。而作为唯一快速有效清除谷氨酸的转运蛋白的表达或功能改变必将影响细胞的生理功能而导致神经系统的病变。我们的结果提示吗啡反复给药对谷氨酸重摄取能力的影响，是通过改变了谷氨酸转运蛋白的表达来实现的。与我们的研究结果类似，其他实验室的研究结果也证实谷氨酸转运能力明显影响吗啡耐受及依赖。Nakagawa等［10］发现谷氨酸转运蛋白的激动剂MS-153可以抑制吗啡的成瘾。吗啡慢性处理后，脊髓内EAAT3和GLAST的表达下降［11］。虽然在吗啡成瘾形成中不同的谷氨酸转运体其改变及作用不尽相同。但总体上而言，加强谷氨酸转运体功能往往可延缓吗啡耐受及依赖的形成。因此，开发可用于临床的谷氨酸转运体增强剂，可能会为吗啡成瘾后复吸的防治带来希望。

关于慢性吗啡处理C6细胞EAAT3表达下降的机制，有报道显示［5］EAAT3表达下调为转录后调节，1 μmol·L－1纳洛酮作用 48 h 可逆转 10 μmol·L－1吗啡诱导的EAAT3表达下降，提示吗啡是通过作用于阿片受体，启动细胞内多种信号通路降低EAAT3表达。而我们研究发现C6细胞在吗啡二次暴露前15 min使用1 μmol·L－1纳洛酮4h即可逆转吗啡二次暴露引起的EAAT3表达下降，提示阿片受体在吗啡多次暴露引起的神经元可塑性中起重要作用。关于各种阿片受体在调控吗啡诱导EAAT3表达改变中的具体作用目前少有报道。动物实验证实，μ受体在吗啡诱导的CPP行为和自身给药行为过程中起主要作用，δ受体对其起调节作用［12］。因C6细胞表达μ受体较多，δ受体数量较少［6］。推测吗啡诱导的C6细胞EAAT3表达下降可能主要通过μ受体起作用。但δ受体是目前报道的唯一对皮层神经元由Glu引起的伤害有保护作用的阿片受体［13］，δ受体激活及表达对EAAT3清除谷氨酸的能力具有调节作用。因此各种阿片受体对氨基酸转运蛋白的调控作用将有待进一步研究。

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