彭公永，周玉民，胡国平，蒋永亮，胡锦兴

(广州医学院笫一附属医院广州呼吸疾病研究所呼吸疾病国家重点实验室，广东广州 510120)

肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMC)在缺氧性肺动脉高压等肺血管疾病发生中具有重要作用［1－2］。肺血管急性缺氧性收缩反应和慢性缺氧性肺血管结构重建是缺氧性肺动脉高压发生的主要机制。新近研究表明，缺氧导致的肺动脉收缩反应和血管结构重建在远端肺动脉表现的比近端肺动脉更显著［3－4］，提示肺动脉高压发生的主要部位在远端肺动脉。尽管原代培养大鼠PASMC的方法已有文献报道，但关于原代培养的大鼠远端PASMC的血管功能研究尚鲜有报道。本研究采用显微操作和胶原酶消化法分离、培养大鼠远端 PASMC，并探索原代培养的大鼠远端PASMC是否具有血管平滑肌的功能，为缺氧性肺动脉高压等肺血管疾病发病机制及药物干预研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 Ⅰ型胶原酶、多聚甲醛、牛血清白蛋白、Triton X-100、小鼠抗大鼠平滑肌α-actin 单克隆一抗、KCl、硝苯地平、NaCl、MgSO4、KH2PO4、NaHCO3、CaCl2、葡萄糖 (美国 Sigma);PBS、DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco);CyTM3偶联山羊抗小鼠IgG二抗(美国Jackson ImmunoResearch);细胞核荧光染料YO-PRO-1、Fura-2 AM(美国Invitrogen);体式显微镜、倒置相差显微镜、激光共聚焦荧光显微镜、荧光显微镜(日本Nikon);双通道温度控制系统(美国Warner Instrument);InCyte细胞内钙浓度检测系统(美国 Intracellular Imaging);显微镊、显微剪(上海金钟)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠远端 PASMC的原代培养 参照文献［5］，取250～300 g♂性SD 大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg·kg－1)麻醉后，取心、肺，体式显微镜下用显微镊、剪分离各肺叶肺动脉。剥除肺动脉血管外膜组织，纵向剪开血管，无菌棉签刮除内膜，留中膜平滑肌组织层。加入3 mlⅠ型胶原酶消化液(1 800 U·ml－1)37℃水浴静置消化 20 min［5］，见组织边缘呈絮状，弃上层消化液，留消化后的平滑肌组织，加入15 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基，用1 ml移液器上下吹吸20次，制成细胞悬液以5×107·L－1接种于6孔培养板中的盖玻片上，于5%CO2培养箱37℃培养。常规换液，倒置相差显微镜下观察。

1.2.2 平滑肌 α-actin免疫荧光染色 取40% ～50%融合的细胞，4%多聚甲醛室温固定15 min，0.25%Triton X-100溶液室温孵育15 min，1%牛血清白蛋白溶液室温封闭30分钟，加入1∶200小鼠抗大鼠平滑肌α-actin单克隆一抗，阴性对照组以PBS代替，室温孵育1 h，1∶500C yTM3偶联山羊抗小鼠IgG二抗室温避光孵育2 h，3.5 ml·L－1YOPRO-1室温避光孵育1 min染核，封片后激光共聚焦荧光显微镜下观察。

1.2.3 高钾溶液对PASMC的细胞内Ca2+浓度(intracellular Ca2+concentration，［Ca2+］i)的影响 实验分对照组、KCl组和硝苯地平干预组。如文献报道［6］，用 5 μmol·L－1的 fura-2 AM 于 5%CO2培养箱37℃避光负载细胞1 h后，将长有细胞的盖玻片固定于荧光显微镜上的观测盒内，用Krebs溶液(118 mmol· L－1NaCl、4.7 mmol· L－1KCl、0.57 mmol· L－1MgSO4、1.18 mmol· L－1KH2PO4、25 mmol·L－1NaHCO3、2.5 mmol·L－1CaCl2和 10 mmol·L－1葡萄糖)以 0.5 ～ 1 ml·min－1的流速灌流孵育细胞15 min，以含16%O2、5%CO2的混合氮气持续平衡灌流液，并用双通道温度控制系统使观测盒内的温度控制在37℃ ～37.2℃。打开荧光显微镜和InCyte细胞内钙离子浓度检测系统，以30 s的间隔实时记录数据。先用Krebs溶液灌流孵育各组细胞5 min，然后，KCl组用高钾Krebs溶液(60 mmol·L－1NaCl、60 mmol·L－1KCl、0.57 mmol·L－1MgSO4、1.18 mmol· L－1KH2PO4、25 mmol·L－1NaHCO3、2.5 mmol·L－1CaCl2和 10 mmol·L－1葡萄糖)灌流孵育细胞10 min，而对照组、硝苯地平干预组分别用 Krebs溶液、含5 μmol·L－1硝苯地平的高钾Krebs溶液灌流孵育细胞10 min，最后，各组细胞再用Krebs溶液灌流孵育10 min。

1.3 统计学方法［Ca2+］i检测实验数据以±s表示，n为提供PASMC的大鼠数，每次检测［Ca2+］i实验的细胞数为20～30，用t检验进行统计分析。

2 结果

2.1 细胞形态学鉴定 倒置显微镜下见细胞贴壁生长，呈长梭形，3 d后呈簇状或并行排列生长(Fig 1A)，6～7 d达90%融合，当细胞完全融合时，表现出典型血管平滑肌细胞“峰、谷”状生长的特点(Fig 1B)。

Fig 1 Phase-contrast microscopy of rat distal PASMC

2.2 平滑肌α-actin免疫荧光鉴定 如Fig 2A，培养细胞对平滑肌α-actin免疫荧光显色呈阳性反应，细胞质中可见典型的、并行排列的、红色荧光显色的平滑肌α-actin蛋白(Fig 2B)，对照组细胞呈阴性反应(Fig 2C)。

Fig 2 Immunofluorescence of smooth muscle α-actin in rat distal PASMC

Fig 3 Effects of high KCl on［Ca2+］iin rat distal PASMC

2.3 高钾溶液对大鼠远端PASMC的［Ca2+］i的影响 如Fig 3A，对照组细胞持续用Krebs溶液孵育25 min，［Ca2+］i随时间变化始终维持基线水平。KCl组细胞先用 Krebs溶液孵育，换用60 mmol·L－1KCl溶液孵育后，PASMC 的［Ca2+］i明显由基线水平迅速增高(Fig 3B)，△［Ca2+］i峰值达(152±74)nmol·L－1(n=5;与对照组比较 P ＜0.05)，而同时期对照组PASMC的△［Ca2+］i峰值仅为(12±6)nmol·L－1(n=5;Fig 3D);再改用 Krebs溶液后，PASMC的［Ca2+］i逐渐恢复基线水平(Fig 3B)。硝苯地平干预组细胞换用含5 μmol·L－1硝苯地平的高钾Krebs溶液孵育细胞后，PASMC的［Ca2+］i无明显变化，5 μmol·L－1硝苯地平能完全阻断PASMC 的［Ca2+］i对 KCl的反应(Fig 3C)，硝苯地平干预组 PASMC的△［Ca2+］i峰值仅为(18±6)nmol·L－1(n=6;与 KCl组比较 P ＜0.05，与对照组比较 P ＞0.05，Fig 3D)。

3 讨论

远端肺动脉是缺氧引起肺动脉收缩和结构重建的主要部位，培养远端PASMC并验证PASMC的血管平滑肌功能是研究缺氧性肺动脉高压发病机制的基础。本实验采用显微外科技术和胶原酶消化法原代培养大鼠远端PASMC，获得PASMC呈长梭形，培养3 d后呈簇状或并行排列生长，1周后细胞融合呈“峰、谷”状生长，表现出典型的血管平滑肌细胞形态学特征，与以往文献报道结果一致［7，8］。

平滑肌α-actin蛋白是血管平滑肌表达的特征蛋白，国内外文献已有诸多报道［7－9］。本实验通过激光共聚焦荧光显微镜免疫荧光染色发现，大鼠远端PASMC平滑肌α-actin免疫荧光染色呈阳性反应，可见典型的、并行排列的红色纤维，证实PASMC表达平滑肌α-actin蛋白，符合血管平滑肌细胞的免疫学结构特征。

文献报道血管平滑肌细胞能对高钾溶液反应，电压依赖性钙通道(voltage-dependent Ca2+channels，VDCC)拮抗剂能抑制此反应［6］。大鼠远端PASMC换用 60 mmol·L－1KCl溶液孵育后，［Ca2+］i由基线水平迅速增高，再换用Krebs溶液孵育后，［Ca2+］i逐渐恢复到基线，表明PASMC能对高钾溶液反应，存在生理功能良好的 VDCC;当PASMC用Krebs溶液孵育后换用含硝苯地平的高钾Krebs溶液孵育，［Ca2+］i并无升高，提示硝苯地平能完全阻断PASMC的［Ca2+］i对高钾溶液的反应，进一步证实PASMC存在生理功能良好的VDCC。

综上，本研究成功原代培养大鼠远端PASMC，所获PASMC不仅具有典型血管平滑肌细胞形态学和免疫学结构特征，而且具备血管平滑肌细胞正常的生理功能，存在生理功能良好的VDCC。大鼠远端PASMC生长达完全融合约需1周，满足普通实验室研究需要，可广泛用于缺氧性肺动脉高压等肺血管疾病发病机制及药物干预的研究。

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