黄军祥，胡咏梅，石 海，许建明

(安徽医科大学第一附属医院1.消化内科、2.科研处，3.安徽省消化系病重点实验室，安徽合肥 230022)

CsA是由真菌产生的一组环状十一肽物质常常用于自身免疫性疾病和器官移植时的抗排斥反应［1］。同时，CsA作为第一代MDR逆转剂通过抑制P-gp的表达，联合其他多种化疗药物起到了良好抗肿瘤增殖作用，最近的文献就报道了CsA可以抑制包括23132/87胃癌细胞和SW-403结肠癌细胞在内的多种肿瘤细胞的生长和增殖，并诱导细胞的凋亡［2］。在有关CsA抑制胃癌细胞增殖和诱导凋亡的研究机制中，CsA对人胃癌细胞的生长抑制和诱导凋亡与药物作用浓度有关，也有研究显示CsA可通过多种机制(MAPK信号路径、NK-1受体、κB核因子等)诱导肿瘤细胞的凋亡［2－3］。但是CsA诱导肿瘤细胞的凋亡与P-gp的表达关系尚不什么明确，因此本文为进一步探讨在人胃癌MGC80-3细胞中两者是否存在某种关联进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料 药品、试剂和仪器:CsA标准品由中国药品生物制品检定所生产(批号:130495-200202，纯度为98.8%)，溶解于新鲜配制的无菌RPMI1640培养基中，经0.22 μm微孔滤膜(美国Pall公司)再次过滤除菌，现配现用。MTT试剂、二甲亚砜(DMSO):美国Sigma公司，P-gp一抗和购自Santa Cruz Biotechnology，INC(美国，进口分装)，二抗购自北京中杉金桥，内参GAPDH购自上海康城，ECL发光试剂盒:美国Pierce公司，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒:上海贝博生物。SPECTRAmax M2e酶标仪:美国Molecular Devices公司，流式细胞仪(BECKMAN COULTER EPICS XL，USA)。

1.2 细胞培养 人胃癌MGC80-3细胞购自于中国科学院上海细胞库，生长于含有10%胎牛血清和12 kU·L－1庆大霉素的RPMI 1640培养液中，在37.0°C、5%CO2饱和湿度培养箱内传代培养，实验均采用对数生长期细胞。

1.3 MTT实验 MGC80-3细胞经胰酶消化收集并稀释为2×107～4×107·L－1的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μl，试验设5个复孔。实验组加系列稀释的 CsA溶液，使其终浓度依次为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μmol·L－1，并设 control组。细胞在37°C 5%CO2培养箱培养24、48、72 h 后，每孔加 5.0 g·L－1的 MTT 20 μl，孵育4 h，吸出全部上清液，再加DMSO 150 μl，振荡混匀。于酶标仪上检测490 nm处吸光度(OD)，实验重复3次。采用公式细胞存活率/%=(实验组 OD/对照组 OD)×100%，计算CsA处理细胞后不同时间段的存活率。

1.4 AO/EB染色观察凋亡细胞的形态 取对数生长期MGC80-3细胞以浓度为1×108·L－1的活细胞悬液在含血清的RPMI 1640培养液基中贴壁24 h后，5.0、15.0、25.0 μmol·L－1CsA 作用细胞 48 h，设control组，加入AO/EB染液避光染色约15 min，置于荧光显微镜下观察细胞形态。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 将对数生长期MGC80-3细胞接种到6孔板中培养24 h，经不同浓度CsA作用48h，胰酶收集细胞后冰PBS洗涤两次，加400 μl 1×Bing Buffer悬浮细胞，调整细胞浓度为1×109·L－1，在 2 ～8 ℃ 条件下加入 5 μl Annexin V-FITC 孵育15 min，再加 10 μl PI避光孵育5 min，FCM检测细胞的凋亡率(激发波长:488 nm)。

1.6 Western blot检测分析 MGC80-3细胞在浓度为0 ～40.0 μmol·L－1CsA作用48 h后用细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白，每孔取20 μl的蛋白上样，在不同浓度SDS-PAGE凝胶中电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5%的脱脂牛奶封闭2 h，一抗按1∶100稀释比例孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min，再按1∶50 000比例将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(二抗)稀释液孵育膜2 h，PBST洗涤3次，每次10 min，于暗室中ECL发光试剂进行显影，扫描仪收集图像，ImageJ软件分析灰度值，以IntDen/Area表示蛋白单位面积上的密度，再以P-gp与GAPDH的比值，即为P-gp的蛋白相对表达量。

1.7 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，实验数据以±s表示，组间样本均数比较采用单因素方差分析，两因素的相关性采用Pearson相关分析。

2 结果

2.1 CsA抑制MGC80-3细胞的增殖 MTT法结果显示，在5.0 ～ 25.0 μmol·L－1浓度范围 CsA 对胃癌MGC80-3细胞增殖有抑制作用，且呈现时效和量效的依赖性，与control组相比，差异有统计学意义(Fig 1)。

2.2 AO/EB染色 不同浓度CsA处理MGC80-3细胞48 h，AO/EB染色后于荧光显微观察，control组细胞形态规则，结构清晰，呈较均匀一致的绿色，较少见凋亡和坏死细胞，而实验组细胞间隙增宽，形态不规则、收缩变圆，随CsA作用浓度的增加凋亡细胞明显增多，晚期凋亡的细胞可见细胞质凝聚、固缩，细胞核碎裂等典型的凋亡特征(Fig 2)。

Fig 1 Effects of CsA on the viability of MGC80-3 cells

Fig 2 Effects of CsA on apoptosis of MGC80-3 cells determined by AO-EB staining(×200)

2.3 CsA诱导MGC80-3细胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI双染原理FCM分析CsA诱导MGC80-3细胞凋亡的影响。不同浓度CsA(5.0、15.0、25.0 μmol·L－1)处理MGC80-3细胞48 h后出现不同程度的凋亡，凋亡率随着药物作用浓度增加而依次升高(Fig 3)，呈现明显的剂量效应关系。本实验重复3次，在双变量流式细胞仪散点图上左下象限为活细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限为晚期凋亡细胞，15.0、25.0 μmol·L－1CsA 作用后导致细胞各期凋亡率与control组相比差异均有统计学意义(P ＜0.05，P ＜0.01)。

Fig 3 Inhibitors of P-gp by CsA induced apoptosis in MGC80-3 cells

2.4 CsA影响MGC80-3细胞内P-gp的表达 在浓度 5.0 ～ 40.0 μmol·L－1范 围 内 CsA 处 理MGC80-3细胞48 h，P-gp表达随CsA作用浓度的增加而逐渐减弱(Fig 4)，当CsA浓度大于或等于10 μmol·L－1时蛋白表达量与control组相比差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

2.5 CsA诱导MGC80-3细胞凋亡与P-gp表达的相关性 Pearson相关分析结果显示P-gp的表达与CsA诱导MGC80-3细胞晚期凋亡率呈负相关(r=－0.722，P=0.028)，与总凋亡率也呈负相关(r=－0.718，P=0.029)，而与细胞早期凋亡相关性差异无统计学意义(r=－0.454，P=0.220)。

Fig 4 Inhibitory effect of CsA on the expression of P-gp in MGC80-3 cells(±s，n=4)

3 讨论

胃癌是目前最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在肿瘤患者中位居第2位。全球由癌症导致死亡的病因中有12%因胃癌引起，在我国胃癌则是肿瘤患者最主要的死因［4－5］。目前针对胃癌患者，特别是进展期胃癌，化疗一直是公认的标准治疗方法;然而肿瘤细胞固有和后天获得的多药耐药性(MDR)和P-gp的过表达是化疗治疗胃癌失败的主要原因之一［6］。CsA可逆转包括P-gp在内的多种耐药蛋白的表达，并增加肿瘤细胞内化疗药物的分布，增强抗癌疗效［7］，Beppu 等［8］的研究也表明联合应用CsA和γ干扰素可明显诱导胃癌MK-1、GCTM细胞凋亡，但是CsA单独应用却无明显的诱导细胞凋亡作用。

本实验通过AO/EB、FCM等方法研究发现单独使用CsA对人胃癌MGC80-3细胞也具有诱导凋亡作用，细胞早期凋亡率和晚期凋亡率都随CsA作用剂量的增加而逐渐增加(P＜0.05，P＜0.01);虽然Beppu 等［8］的研究显示 5.0 μmol·L－1CsA 单独应用处理胃癌细胞并无明显诱导凋亡作用，这可能与选择CsA作用剂量偏低和细胞株的差异有关;Roy等［9］研究也表明高剂量的CsA可诱导细胞活性的丧失和抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，这与本实验结果相类似。本研究还显示CsA对MGC80-3细胞生长和增殖抑制作用与所加药物呈现时效和量效的依赖关系，和文献报道的研究结果基本一致［2］，因此CsA作用于胃癌细胞也表现出良好的抗肿瘤增殖活性。

P-gp的高表达与胃癌恶性程度相关，抑制P-gp表达活性可明显改善胃癌患者的预后［10］，文献报道了在胃癌SGC7901/VCR细胞中减少P-gp的表达量可促进细胞的凋亡［6］。实验结果表明:CsA处理MGC80-3细胞48 h后，P-gp表达量呈浓度依赖性下降(P ＜0.05，P ＜0.01)，Annexin V-FITC/PI双染FCM分析数据联合Western blot检测表明CsA抑制MGC80-3细胞P-gp表达活性作用越强，诱导细胞凋亡的趋势越明显，因此我们推测P-gp表达的变化可能是影响细胞凋亡的重要因素之一。

由于大多数化疗药物均可通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤生长和增殖，因此诱导细胞凋亡是目前临床用于肿瘤治疗的较为理想的治疗手段之一［11－12］。然而P-gp的过表达导致对许多化疗药物的普遍耐药使得肿瘤细胞抗细胞凋亡作用日益突出［13］，本实验研究了CsA诱导MGC80-3细胞的凋亡和下调P-gp表达，Pearson相关分析显示CsA抑制P-gp表达与MGC80-3细胞的凋亡存在相关性，因此P-gp的表达可能参与了CsA诱导细胞凋亡的过程。研究显示［14］逆转肿瘤细胞耐药性、抑制P-gp的功能和表达促进了胃癌SGC7901/VCR细胞的凋亡，其机制可能与诱导caspase-3活化有关。为此希望在后续的研究中进一步证实CsA抑制MGC80-3细胞P-gp表达与诱导凋亡的相关机制，为临床针对多药耐药肿瘤，特别是P-gp表达阳性的进展期胃癌，选择合理的治疗方案提供参考和科学依据。

［1］ Twentyman P R.Cyclosporins as drug resistance modifiers［J］.Biochem Pharmacol，1992，43(1):109 －17.

［2］ Mu～noz M，Rosso M，González A，et al.The broad-spectrum antitumor action of cyclosporin A is due to its tachykinin receptor antagonist pharmacological profile［J］.Peptides，2010，31(9):1643－8.

［3］ Nakahara C，Nakamura K，Yamanaka N，et al.Cyclosporin-A enhances docetaxel-induced apoptosis through inhibition of nuclear factor-κB activation in human gastric carcinoma cells［J］.Clin Cancer Res，2003，9(14):5409 －16.

［4］ Crew K D，Neugut A I.Epidemiology of gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2006，12(3):354 － 62.

［5］ Yang L.Incidence and mortality of gastric cancer in China［J］.World J Gastroenterol.2006，12(1):17 －20.

［6］ Zhang L，Hu J F，Li G Q，et al.Rosiglitazone reverses mitomycin C resistance in human gastric cancer cells［J］.Am J Med Sci.2012，343(5):382 －7.

［7］ Qadir M，O'Loughlin K L，Fricke S M，et al.Cyclosporin A is a broad-spectrum multidrug resistance modulator［J］.Clin Cancer Res，2005，11(6):2320 －6.

［8］ Beppu K，Morisaki T，Matsunaga H，et al.Inhibition of interferon-gamma-activated nuclear factor-kappa B by cyclosporin A:A possible mechanism for synergistic induction of apoptosis by interferon-gamma and cyclosporin A in gastric carcinoma cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，305(4):797 －805.

［9］ Roy M K，Takenaka M，Kobori M，et al.Apoptosis，necrosis and cell proliferation-inhibition by cyclosporine A in U937(a human monocytic cell line)［J］ .Pharmacol Res，2006，53(3):293 －302.

［10］ Fujii H，Tanigawa N，Muraoka R，et al.Clinical significance of multidrug resistance and P-glycoprotein expression in patients with gastric carcinoma［J］.J Surg Oncol，1995，58(1):63 － 9.

［11］ Mahalingam D，Oldenhuis C N，Szegezdi E，et al.Targeting TRAIL towards the clinic［J］.Curr Drug Targets，2011，12(14):2079－90.

［12］ Hu W，Kavanagh J J.Anticancer therapy targeting the apoptotic pathway［J］.Lancet Oncol，2003，4(12):721 －9.

［13］ Klymenko S V，Ilyenko I N，Golarnik N A，et al.Membrane transport and apoptosis-related proteins in radiation-associated acute myeloid leukemia following the Chornobyl accident［J］ .Gen Physiol Biophys，2009，28(1):63 －9.

［14］ Tang X Q，Bi H，Feng J Q，et al.Effect of curcumin on multidrug resistance in resistant human gastric carcinoma cell line SGC7901/VCR［J］.Acta Pharmacol Sin，2005，26(8):1009 －16.