王 菊，陆兔林，2，毛春芹，肖永庆，顾娟娟

(1.国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心、国家中医药管理局中药炮制标准重点研究室、江苏省中药炮制重点实验室，江苏南京 210046;2.南京中医药大学药学院，江苏南京 210046;3.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

莪术为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val、广西莪术 Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或温郁金 Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎，莪术临床应用广泛，是一种有很大开发潜力和广阔市场前景的中药［1－2］。

在肝脏中含量较高的细胞色素P450(CYP450)是最重要的药物代谢酶，药物进入体内受CYP450代谢转化，同时影响CYP450的表达水平，诱导和抑制其同工酶的活性［3－5］。Cocktail探针药物法能对多种同工酶同时进行测定，省时，经济且个体间差异小，在药动学研究和临床合理用药方面有重大意义［6－7］。

莪术临床应用广泛，且临床上应用较多的是醋莪术。据大量文献证明，醋制从增强疗效来看，确与中医基本理论相符，但醋莪术增效的作用机制尚不明确。本实验以茶碱、氨苯酚、氯唑沙宗为探针底物，考察生、醋莪术对CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1活性的影响，以探讨莪术醋制前后与醋制增效的相关性，从而为临床合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)包括:四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器;色谱柱:Kromasil C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);Anke TGH016C 离心机(上海安亭科学仪器厂);XW-80A微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司);MTN-2800W氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);电子天平(Mettler Toledo AG285);

1.2 药物与试剂 茶碱(批号:100121－199903);氯唑沙宗(批号:100364－200301);安替比林(批号:100506－200301);以上对照品均购自中国药品生物制品检定所，用于含量测定。氨苯酚(购自Sigma公司，用于含量测定)。乙腈为色谱纯;乙酸乙酯为分析纯;重蒸水为自制。

1.3 提取液的制备 取净莪术，参照2010版《中国药典》制得生、醋莪术饮片，粉碎，过筛(3号)。取生品及醋品适量，分别加15倍量的体积分数为0.90的乙醇加热回流两次，提取液减压浓缩至无醇味，制得生、醋莪术药液。

1.4 动物及给药方法 ♂性SD大鼠，18只，体质量(250±20)g，由南京中医药大学实验动物中心提供，从上海斯莱克实验动物有限责任公司购买，合格证号:SCXK(沪)2007一0005。动物随机分为空白组、生莪术组及醋莪术组。生、醋莪术组分别单次灌胃给予生、醋莪术药液(9 g·kg－1:约为临床剂量的10倍)，空白组给予同等剂量的生理盐水。给药5 min后灌胃给予茶碱(30 mg·kg－1)、氨苯酚(20 mg·kg－1)和氯唑沙宗(50 mg·kg－1)混合探针药液。分别于给药前 0 h 和 0.05、0.15、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、6、8、10、12 和24 h 从眼底静脉丛采血。4 000 r·min－1离心10 min后取血浆于－20℃保存待用。

1.5 大鼠含药血浆样品处理 精密吸取大鼠血浆100 μl，加入内标液 20 μl，加入乙酸乙酯 800 μl，涡旋震荡 2 min，14 000 r·min－1离心 10 min，分取有机相700 μl，氮气吹干后加30%乙腈100 μl溶解。

1.6 色谱条件 Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相以乙腈(A)－ 水(B)，洗脱程序:0～10 mim，A为12% ～40%;10～22 min，A为40%;22～24 min，A 为40% ～12%;24～30 min，A为12%。流速1.0 ml·min－1;检测波长280 nm;柱温 35℃;进样量 10 μl。

1.7 血浆标准曲线的制备 取空白血浆100 μl，加入20 μl系列浓度的混合对照品溶液，使血浆中各化合物的系列浓度分别为茶碱 32.64、26.11、16.32、6.528、3.264、1.306、0.6528 mg·L－1;氨苯酚:32.61、26.09、16.30、6.522、3.261、1.304、0.6522 mg·L－1;氯唑沙宗:16.96、13.57、8.480、3.392、1.696、0.6784、0.3392 mg·L－1。加入 20 μl内标后，其余操作步骤按“1.5大鼠含药血浆样品处理”项下确定的方法进行。

1.8 统计学处理 茶碱、氨苯酚和氯唑沙宗的药动学参数采用DAS1.0软件计算，各探针的药动学参数差异以配对t检验进行统计分析。

2 结果

2.1 色谱行为 本实验条件下，3种探针药物与内标分离良好，无杂峰干扰测定，基线平稳。本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的茶碱、氨苯酚、氯唑沙宗的浓度，重现性好。见Fig 1。

2.2 标准曲线 根据血浆标准曲线所测结果，将探针药物和内标的峰面积比值对探针药物的量浓度进行线性回归，得回归方程，茶碱:Y=0.2154X－0.0358，r=0.9982;氨苯酚:Y=0.2849X －0.3008，r=0.9971;氯唑沙宗:Y=0.3642X－0.0398，r=0.9982。

2.3 精密度与提取回收率 考察日内与日间精密度。按标准曲线制备方法制备高、中、低3个浓度的质控血浆样品，每个浓度平行5份，随行同日标准曲线计算求得精密度，结果表明日内和日间精密度均小于15%。同时测得探针药物的提取回收率分别为:茶碱(83.0±2.5)%、氨苯酚(76.0±6.7)%、氯唑沙宗(90.1±4.5)%。

2.4 稳定性考察 本实验考察了血浆样品在室温下放置24 h、3个冻融循环后的样品稳定性，发现茶碱、氨苯酚及氯唑沙宗的血浆样品在室温下放置24 h及反复冻融3次后测定结果稳定。

Fig 1 Chromatograms of the assay

2.5 药动学参数

2.5.1 3种探针药物的药－时曲线 大鼠灌胃生、醋莪术后，按“1.4”项下方法操作，测得3种探针药物的血药浓度，结果见Fig 2。由Fig 2可知，大鼠给予生莪术后，氨苯酚及氯唑沙宗的Cmax有所降低，但与空白组差异无显著性。茶碱的Cmax虽明显增大但其他药动学参数无变化;大鼠给予醋莪术后，茶碱与氨苯酚的Cmax明显降低。结合其他药动学参数，实验结果表明，生莪术对3种亚型酶活性影响并不明显，醋莪术对CYP1A2和CYP2E1具有抑制作用，对CYP3A4具有诱导作用。

2.5.2 3种探针药物的药动学参数 茶碱、氨苯酚和氯唑沙宗的药代动力学数据经中国药理学会推荐的DAS1.0程序处理，3种探针药的药动学参数见Tab 1。

Fig 2 Pharmacokinetic profile of probe drugs in plasma

Tab 1 Pharmacokinetic parameters of three probe drugs(n=6)

单次给以大鼠生、醋莪术后，生莪术的茶碱、氨苯酚和氯唑沙宗的药动学参数与空白组相比差异没有显著性;但醋莪术与空白组相比，茶碱的、Tmax和AUC明显增加，Cmax、CL/F明显降低;氨苯酚的变化不明显，AUC明显降低，CL/F明显增加;氯唑沙宗的、Tmax、AUC 明显增加，CL/F 明显降低。

3 讨论

实验结果表明，生莪术对3种亚型酶活性影响并不明显，这可能与单次给药有关。醋莪术对CYP1A2和CYP2E1具有抑制作用，对CYP3A4具有诱导作用。莪术临床应用广泛，但中医临床上应用较多的是醋莪术，通过炮制改变药物代谢酶的活性，因此在临床上使用醋莪术时，合并使用经CYP1A2、CYP3A4和 CYP2E1代谢的药物，应充分考虑其给药剂量对合用药物代谢的影响，必要时应注意调整合用药物的给药剂量，从而为临床制定合理的给药方案提供依据，将可能出现的不良代谢性药物相互作用降到最低程度。

本实验采用“Cocktail”探针药物法研究了生、醋莪术对大鼠CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1这3种亚型的酶的作用并进行比较，为联合给药时给药方案的制定提供理论支撑，为探讨莪术醋制增效的机制提供一定依据，并很好的指导临床安全、有效、合理用药。

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