贺 敏，王静凤，柳 东，李 冰，王玉明，薛长湖

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003)

海参营养和功效成分丰富，对人体具有很好的保健功能。海参体壁中富含海参多糖、海参皂苷、海参胶原蛋白、海参脑苷脂等多种活性物质，具有较高的食用和药用价值［1－2］。海参皂苷是海参的主要次生代谢产物，一般为羊毛甾烷型三萜皂苷，具有抗肿瘤、抗真菌、免疫调节、细胞毒作用和溶血作用等多种生理活性［3－4］。海参皂苷的结构因其种类和生长环境的不同而不同。革皮氏海参体壁中富含海参皂苷(含量为3.514%)，可作为海参皂苷的良好来源。王静凤等［5］研究发现，革皮氏海参总皂苷对小鼠具有明显的免疫调节作用。刘治东［6］研究发现，革皮氏海参总皂苷能明显抑制小鼠移植瘤的生长，并能明显提高小鼠体内抗氧化和代谢致癌物质的能力。李冰等［2］从造血干细胞增殖和分化方面进行研究，发现革皮氏海参皂苷对骨髓损伤模型小鼠有促进造血的作用，但其作未用机制尚不明确。本实验从细胞水平研究了革皮氏海参皂苷对骨髓细胞周期和凋亡的影响，进一步探讨海参皂苷促进骨髓抑制模型小鼠造血功能恢复的分子机制。

1 材料

1.1 海参 革皮氏海参(Pearsonothuria graeffei)，购于青岛南山市场，中国科学院海洋研究所研究员廖玉麟对其进行种属鉴定。

1.2 实验动物 健康♂ ICR小鼠，18～20 g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号为 SCXK(京)2007-0001。饲养温度22～24℃，相对湿度52% ～58%，12:12 h明暗交替。

1.3 主要试剂 环磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)，为上海华联制药公司产品;碘化丙碇(propidium iodide，PI)、羧甲基纤维素，由Sigma公司提供;TRIzol Reagent，Invitrgen 产 品;TaqDNA 聚合酶、dNTPs、RNase Free水、DNA Marker DL2000，为 TaKaRa产品;M-MLV Reverse Transcriptase，为 Promega产品;AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒，为瑞士罗氏公司产品;CyclinB1、bcl-2、bcl-xl及 β-actin上下游引物由上海生工生物技术有限公司合成;其它试剂均为国产分析纯。

1.4 主要使用仪器 BJ5060UV型CO2培养箱，德国Heraeus公司;Mini-Protean电泳仪，日本 BIORAD公司;FACS.VAN.TAGE流式细胞仪，美国BD公司产品;GL-20M型高速冷冻离心机，上海卢湘离心机仪器有限公司;TC-96 Life Pro基因扩增仪，杭州博日科技有限公司;DYY-6C型稳压稳流电泳仪，北京市六一仪器厂;JS-780型全自动凝胶成像分析仪，上海培清科技有限公司。

2 实验方法

2.1 革皮氏海参皂苷的制备 革皮氏海参干品粉碎成粉，按1∶10(m/V)的料液比用体积分数60%的乙醇溶液提取。合并提取液，减压浓缩，得到的流浸膏分散于水中，过HP-20型大孔树脂柱，以80%乙醇洗脱，收集洗脱组分，减压浓缩、真空冷冻干燥，得到革皮氏海参总皂苷。采用香草醛－冰乙酸比色法测定所得海参皂苷的纯度为65.04%。临用时用0.5%羧甲基纤维素配制。

2.2 动物分组及模型建立 ICR小鼠适应性喂养7 d，随机分为4组，每组10只。给药组分别灌胃不同浓度的海参总皂苷溶液［分别为10和30 mg(kg·bw)－1］，正常对照组灌胃0.5%羧甲基纤维素，灌胃体积为0.01 ml(g·bw)－1，1 天 1 次，连续 16 d。除正常对照组外，其余3组均于首次给药后第7 d，腹腔注射 Cy 100 mg·kg－1，1 天 1 次，连续 3 d，造模。于末次给药2 h后，脱颈椎处死，无菌剥离股骨，备用。

2.3 骨髓有核细胞计数 参见文献［7］方法，用5 ml 3%的醋酸溶液冲出髓腔内全部细胞，制成单细胞悬液，血球计数板计数，计算出每根骨髓含有的有核细胞数。

2.4 流式细胞术检测骨髓细胞周期分布 用5 ml生理盐水冲出髓腔内全部细胞，制成单细胞悬液，收集1×106个细胞，经PBS洗2次，用预冷的75%乙醇固定24 h。固定的细胞经PBS洗涤2次，加入PI染液 (50 mg/L－1PI、0.1 g/L－1RNase A、0.1%Triton-X 100)，置4℃避光染色30 min，随即进行流式细胞仪检测细胞。每个样本均获取10 000个细胞，采用WinMDI 2.9软件系统进行细胞周期分析。

2.5 流式细胞术检测骨髓细胞凋亡率 取1×106个骨髓细胞，参照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒方法处理后，采用流式细胞仪检测。以未染色细胞调零，以Annexin V-FITC单染管和PI单染管做为基准参照，测定每个上样管数据，每个样本均获取10 000个细胞，用WinMD 2.8软件进行分析。

2.6 对细胞周期调控基因cyclin B1和抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl mRNA表达的影响 采用TRIzol法提取骨髓细胞总RNA。取1 μg总RNA逆转录成cDNA，以逆转录反应所得cDNA为模板进行RTPCR反应。反应体系包括 cDNA 3 μl，MgCl2(25 mM)1.8 μl，10 × PCR buffers 3 μl，dNTP(10 mmol·L－1)1.2 μl，TaqDNA 聚合酶(5 U/μl)1 μl，10 μmol·L－1引物各 0.6 μl，以 RNase Free 水补足体积至30 μl。PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性45 s;退火30 s;72℃延伸45 s，循环结束后72℃延伸10 min。引物设计见Tab 1。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，利用 Image J(version 1.41o)图像分析软件分析各目的基因条带的灰度值，以β-actin作内参校正，用目的基因灰度值与βactin灰度值的比值表示目的基因的相对表达量。

Tab 1 Primer sequences，length of products，annealing temperature and cycles of different genes

3 结果

3.1 对骨髓有核细胞数的影响 骨髓有核细胞数代表骨髓的造血能力。结果如Fig 1所示，模型对照组的骨髓有核细胞数降低，与正常对照组比较，降低了30.89%(P＜0.05)。灌胃低高剂量革皮氏海参总皂苷后，骨髓有核细胞数增加，与模型对照组比较，分别增加了42.32%和32.25%(P＜0.01，P＜0.05)。表明革皮氏海参总皂苷可有效减轻Cy对模型小鼠骨髓细胞抑制的作用，恢复骨髓造血功能。

Fig 1 Effect of saponins of P.graeffei on the number of BMC in mice

3.2 对小鼠骨髓细胞细胞周期分布的影响 结果如Tab 2所示，与正常对照组比较，模型小鼠骨髓细胞周期S期百分率上升，G2/M期百分率下降，说明环磷酰胺使骨髓细胞细胞周期发生S期阻滞。经革皮氏海参总皂苷作用后，模型小鼠骨髓细胞周期分布发生改变，低、高剂量组小鼠S期骨髓细胞数较模型组分别降低了37.90%和25.86%，G2/M期分别提高了408.5%和221.6%。表明革皮氏海参总皂苷使骨髓细胞周期由S期向G2/M期转变，促进骨髓细胞增殖。

Tab 2 Effects of saponins of P.graeffei on the cell cycle of BMC

3.3 对小鼠骨髓细胞凋亡的影响 结果如Fig 2所示，与正常对照组比较，模型小鼠骨髓细胞凋亡率明显上升，为22.8%(P＜0.01)，说明环磷酰胺可诱导小鼠骨髓细胞凋亡。与模型对照组比较，低高剂量组小鼠骨髓细胞凋亡率明显降低，分别为15.0%和11.2%(P＜0.01，P＜0.01)。表明，革皮氏海参总皂苷可明显降低骨髓损伤小鼠骨髓细胞的凋亡率，且剂量效应关系明显。

3.4 对小鼠骨髓细胞周期基因cyclin B1mRNA表达的影响 Cyclin B1是控制细胞进入G2/M期的关键因子。革皮氏海参总皂苷能上调模型小鼠骨髓细胞cyclin B1 mRNA的表达，且剂量效应关系明显(见Fig 3)。与模型对照组比较，低、高剂量组小鼠cyclin B1 mRNA表达量分别升高了20.19%和82.35%(P ＜0.05，P ＜0.01)。

3.5 对抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl mRNA表达的影响 Bcl-2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质，bcl-2对抗各种凋亡的刺激而对细胞起保护作用，bcl-xl通过阻止细胞色素C和凋亡诱导因子的释放，从而阻止细胞凋亡。结果如Fig 3所示，与正常对照组比较，环磷酰胺引起的骨髓抑制小鼠的抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl表达量减低(P＜0.01，P＜0.01)，表明环磷酰胺可引起小鼠骨髓细胞凋亡。与模型对照组比较，皂苷低高剂量组小鼠的bcl-2和bcl-xl mRNA的表达增加，且剂量效应关系明显。其中，低高剂量组bcl-2 mRNA的表达量分别提高了31.2%(P＜0.05)和58.1%(P＜0.01)，bcl-xl mRNA表达上调了24.4%(P＜0.01)和37.8%(P＜0.01)。

Fig 2 Effects of saponins of P.graeffei on the apoptosis of BMC cells in mice

4 讨论

本实验采用流式细胞技术和分子生物学等手段研究了革皮氏海参总皂苷对环磷酰胺引起的骨髓抑制模型小鼠骨髓细胞生长的影响及其分子机制。结果表明，革皮氏海参总皂苷可增加骨髓有核细胞的数量，改善由环磷酰胺导致的S期阻滞，促进骨髓抑制模型小鼠骨髓细胞周期由S期向G2/M转变，并进一步证明促进模型小鼠骨髓细胞周期基因Cyclin B1 mRNA的表达;而且革皮氏海参总皂苷可显著降低模型小鼠骨髓细胞凋亡率，提高模型小鼠抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl mRNA表达，提示革皮氏海参总皂苷可通过抑制骨髓细胞凋亡，促进骨髓细胞增殖而达到促进造血的目的。

骨髓细胞周期是反映造血系统造血功能的重要指标之一，细胞周期各个时相的分布情况可以反映骨髓细胞增殖的状态。细胞周期的主要调节成分是细胞周期蛋白(cyclins)和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 (cyclin dependent protein kinases，CDKs)。细胞周期蛋白 cyclin B1［8－11］与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶CDKs结合，受磷酸化、去磷酸化调节，所形成的活性复合物能转位入核，磷酸化其核内底物，促进细胞的G2/M期转变。王勇等［12］报道，人参总皂苷可促进骨髓细胞由相对静止期G0/G1期进入增殖活跃期G2/M期。另有研究表明，红景天苷促使骨髓抑制贫血小鼠骨髓细胞从S期向G2/M期转化。提示皂苷类物质可抑制由环磷酰胺引起的S期阻滞。

Fig 3 Effect of saponins of P.graeffei on mRNA expression of cyclinB1，bcl-xl and bcl-2 in BMC

Bcl-2蛋白家族是调节细胞凋亡的主要基因蛋白，分为抗凋亡(bcl-2、bcl-xl等)和促凋亡(bax、bad 等)两大亚家族［13］。bcl-2［14］能抑制极广泛的凋亡因素引发的凋亡，延长细胞寿命。bcl-xl［15－16］参与负调控线粒体介导的细胞凋亡过程，通过与Bcl-2家族促凋亡蛋白形成异源二聚体，影响后者的促凋亡作用，从而最终阻止线粒体释放细胞色素C起到抑制细胞凋亡的作用。研究证实［17］，抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl表达增强，可抑制由环磷酰胺造成的骨髓细胞凋亡，实现对骨髓抑制小鼠骨髓细胞增殖和修复的目的。

综上所述，革皮氏海参总皂苷促进骨髓抑制小鼠造血功能的恢复。其作用途径可能通过调节骨髓细胞周期分布，提高细胞周期蛋白cyclin B1的表达水平，刺激造血细胞增殖，并通过提高抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl的表达，抑制造血细胞凋亡。

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