李 曦，尹金宝，钟志超，范洪领，许黎娟，郑原印，蔡仕宁，常全忠

(1.遵义医学院珠海校区生理学教研室，广东珠海 519041;2.广东医学院东莞校区病理学教研室，广东 东莞 523770)

资料显示，氯通道可能在多种非神经细胞凋亡过程中起重要的作用［1－2］。Takahashi等［3］在转基因小鼠中利用STS诱导培养心肌细胞凋亡，结果显示氯通道阻断剂DIDS和NPPB能够抑制缺血心肌细胞的凋亡，认为ClC-3氯通道可能参与缺血心肌细胞的凋亡。

目前对氯通道是否参与缺血性脑损伤后海马神经元的凋亡过程报道甚少。本研究模拟脑缺血性脑损伤一氧化氮(NO)过量产生的机制，利用SIN-1作为NO供体诱导离体大鼠海马神经元凋亡，试图通过观察氯通道的活动是否参与了神经元的凋亡过程，探讨缺血缺氧敏感性神经元的凋亡与氯通道之间的关系，为临床脑缺血神经元损伤产生机制的研究和治疗提供新的实验参考。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 新生1 d SD大鼠由遵义医学院珠海校区动物实验中心提供;Neurobasal培养基、B27购自Gibco BRL公司，多聚赖氨酸(poly-D-Lysine，PLL)、阿糖胞苷、DIDS(4，4'-diisothiocyanatostilbene-2，2'disulfonic acid)、MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium)SIN-1(3-morpholinosyndnomine)、Poly(ADP-ribose)polymerase-1(PARP-1)、Apoptosis-inducing factor(AIF)和Hoechst 33258等试剂购自美国Sigma公司;胎牛血清(杭州四季青公司);二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(香港试剂公司);Anti-Caspases-3(Santa Cruz)。

1.2 海马神经元的培养 参照方法［4］取生1 d内的SD大鼠，♀♂不拘，无菌断头取脑，在冰冷DHank's里分离双侧海马，剪成约1 mm3小块，用0.25%浓度的胰蛋白酶37℃ 消化15 min，加基础培养基终止消化，机械吹打分散细胞，400目筛网过滤，制成单细胞悬液，1 000 r·min－1室温离心10 min，去上清液，加完全培养基，吹打分散细胞后制成4×108个·L－1的单细胞悬液，接种在预先包被有PLL的24孔或96孔培养扳内，置于培养箱内，通以95%空气、5%CO2，37℃饱和湿度下培养。……