陈冬莲，侯华新，郑 华，梁 燕，黎丹戎

(广西医科大学药学院，广西南宁 530021)

越来越多的研究表明自噬在肿瘤发生发展中起着重要作用，且肿瘤的放化疗过程可诱导细胞发生自噬性死亡，如Peng等［1］在研究小檗碱对A549放射增敏作用过程中发现放射增敏与细胞自噬能力之间有着紧密的联系。本课题前期实验已证实广西产何首乌中无细胞毒作用浓度5 mg·L－1大黄素联合2Gy射线照射对鼻咽癌细胞CNE-1具有明显的放射增敏作用，放射增敏比为 1.39［2］，为了研究大黄素在放射增敏过程中是否伴随着自噬的发生及其作用机制，本实验通过电镜观察大黄素在放射增敏过程鼻咽癌细胞CNE-1自噬体形成的超微结构变化，real-time PCR定量检测自噬相关基因的表达，探讨放射增敏与自噬发生的关系。

1 材料

1.1 细胞来源 人鼻咽癌高分化CNE-1细胞由广西医科大学实验中心提供。

1.2 主要试剂 大黄素由课题组前期从广西何首乌分离获得并经结构鉴定，纯度为99%。实验中加入无细胞毒作用浓度5 mg·L－1。TRIzol REAGENT(Invitrogen公司，美国)、异丙醇和三氯甲烷为国产分析纯试剂、DEPC处理水、RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司，美国)、Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche公司出品)、灭菌注射用水、RPMI 1640(Gibco公司)

1.3 主要仪器 超低温高速离心机5810 R(德国Eppendorf公司)、ABI 7300 Real-time PCR 仪、Nano Drop 2000(Thermo公司)、凝胶成像仪(BIO-RAD)、倒置相差荧光显微镜Axiovert 200。采用60Co射线(加拿大Theratronics产品)为照射源，剂量率94.41 cGy·min－1，根据实验要求进行相应剂量的照射。

1.4 引物序列 根据 NCBI数据库提供的人ULK1、GABARAPL1、Beclin1、Bcl-2 核酸序列，设计特异PCR引物，以β-actin作为内参照，引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成，其引物序列及产物大小见Tab 1。

Tab 1 Primer sequences and product lengths

2 方法

2.1 细胞培养 细胞于37℃ 体积百分数为5%CO2培养箱内，以含体积百分数为10%小牛血清的RPMI 1640培养液在培养瓶内单层传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

2.2 实验分组 实验分成4组，空白对照(A组):用1640完全培养基培养。大黄素(B组):给予无细胞毒终浓度为5 mg·L－1的大黄素，药物作用24 h，继续培养16 h。照射(C组):给予60Co2Gy照射后，继续培养16 h。放射增敏(D组):终浓度为5 mg·L－1大黄素作用细胞24 h后给予60Co2Gy照射，细胞继续培养16 h。

2.3 透射电镜观察细胞超微结构 各组细胞经上述处理后，用PBS漂洗细胞表面3次，胰酶消化后将细胞离心成团，加入预冷的质量分数为3%戊二醛，4℃过夜，送检。

2.4 Real-time PCR法检测ULK1、GABARAPL1、Beclin1和Bcl-2 mRNA表达 各组细胞经上述处理后，提取细胞总RNA，经Nano Drop 2 000定量测定浓度，1.9≤A260/A280≤2.1，10 g·L－1琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。取2 μg总 RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。PCR反应条件见Tab 2。

Tab 2 PCR amplification reaction conditions of target gene

参照文献［3］的方法建立标准曲线。根据以下公式求出目的基因相对表达指数 F=10△CT，T/AT△CT，R/AR

该公式中，△CT，T表示实验组减去空白对照组目的基因Ct值的差，△CT，R表示实验组减去空白对照组内参基因Ct值的差，AT表示目的基因标准曲线的斜率，AR表示内参基因标准曲线的斜率，F表示的是实验组目的基因相对于空白对照组的表达量，将其作为定量结果并用于分析。

3 结果

3.1 鼻咽癌各组细胞超微结构的变化 在透射电镜下，与空白对照组比较，各实验组均观察到细胞胞质中空泡增多，线粒体肿胀变性，在这些变性的细胞器周围出现空泡状结构，有的被双层膜环绕，形成典型的自噬体和自噬溶酶体的自噬现象，以大黄素组和放射增敏组尤为明显，结果见Fig 1。

Fig 1 Autophagosomes found under TEM(n=3)

3.2 鼻咽癌各组细胞自噬相关基因表达情况ULK1、Beclin1、GABARAPL1、Bcl-2 基因的荧光定量PCR扩增曲线基本拟合良好，各基因标准曲线的相关系数0.99以上和扩增效率90% 以上，说明 PCR反应体系稳定，结果可靠。各实验组基因mRNA表达情况结果见Fig 2。

Fig 2 ULK1，GABARAPL1，Beclin1，Bcl-2 mRNA expression in different groups of CNE-1 cells(n=3)

与空白组比较，各组ULK1mRNA表达均升高(P＜0.05)，其中大黄素增敏组表达最高(P＜0.01);而Beclin1和Bcl-2 mRNA表达下调，但与对照组比较差异无统计学意义;GABARAPL1除大黄素增敏组明显升高外(P＜0.05)，其它各组变化不明显(P＞0.05)。

4 讨论

细胞自噬是生物有机体适应不同环境的有效的内部调节机制，它的发生发展主要分为4个阶段［4］:①细胞受到诱导，在胞质内形成小而扁平的由双层膜构成的自噬泡;②自噬泡延伸，包裹受损的细胞器和变性蛋白及核酸等，形成密闭的球状自噬体;③自噬体可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡等;④形成自噬溶酶体。自噬过程中出现的特殊结构及其形态，可以通过透射电镜观察到。本研究的电镜结果发现除空白对照组外，其余各组均出现了自噬泡或自噬体，特别是大黄素放射增敏组出现大量的自噬体及自噬溶酶体。可以推测，大黄素放射增敏作用可能与大黄素属于生物还原性物质，易于穿透细胞膜，聚集于胞质内，产生活性氧，引起细胞线粒体等细胞器的损伤，导致细胞的过度自噬有关。

细胞自噬往往是一把双刃剑，它可使细胞器自我更新，维持细胞自身代谢从而抵抗外部环境的影响，而自噬的过度激活又可导致细胞内各种细胞器受损，发生自噬性死亡。自噬的发生涉及多个基因、多条途径的复杂的程序化过程，一系列自噬相关基因有序的参与其中。ULK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，当上游自噬信号被激活后，ULK1发生去磷酸化，与多种自噬相关基因形成启动自噬的关键复合物，促进下游自噬信号激活［5－6］。GABARAPL1 主要结合于自噬体或溶酶体膜上，该基因的上调可使形成的独特膜性结构(phagophore)不断延伸，直至完全包裹待降解的细胞质组分 ，由此形成自噬体。当自噬体和溶酶体融合后，GABARAPL1表达量下降［7］。本研究发现，与空白对照细胞比较，低剂量射线、无细胞毒剂量大黄素与细胞作用后，细胞通过自噬，产生应急反应，促使细胞对抗环境的变化，保持细胞的稳定状态而免受损伤。而放射增敏组的ULK1急剧升高，GABARAPL1 mRNA呈现过表达，可能此时过多的细胞器或者蛋白质进入自噬小泡而被降解，细胞的功能严重受损，出现不可逆的改变，从而导致细胞进入自噬性死亡阶段。

有文献研究表明，自噬与凋亡在某些情况下受控于同一刺激物并产生不同的细胞反应，两者的相互作用取决于受试物和细胞所处的环境［8］。Beclin1基因是细胞自噬过程中重要的正调节因子。它主要通过与PI3K3C形成复合体来调节其它的自噬相关蛋白在自噬前体结构中定位［9］。已有文献证实通过上调Beclin1在哺乳动物细胞中的表达能够刺激自噬的发生。Bcl-2是调节凋亡的重要蛋白之一，定位于线粒体、内质网和连续的核膜上，Bcl-2 mRNA表达下降自噬增加。此外Beclinl可以通过BH3结构域与Bcl-2的相互作用并抑制自噬体形成。当细胞内环境稳定时，Beclin1与Bcl-2相互结合，抑制细胞自噬，当内环境被打破后，二者分离，Beclin1依赖的自噬增加［10］，可见 Beclin1与 Bcl-2表达与自噬和凋亡活性密切相关。本研究显示，在不同的条件下，各组细胞Beclin1、Bcl-2 mRNA表达情况出现下降。这可能是由于细胞受到药物或射线等刺激后，细胞内环境被破坏，Beclin1与Bcl-2结合程度不同，部分细胞进入了凋亡程序性死亡通道。究竟大黄素在放射增敏过程中如何实现对自噬性死亡和凋亡程序性死亡的调控，有待进一步深入研究。

［1］ Peng P L，Kuo W H，Tseng H C，Chou F P.Synergistic tumorkilling effect of radiation and berberine combined treatment in lung cancer:the contribution of autophagic cell death［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2008，70(2):529 －42.

［2］ 刘 瑛，侯华新 ，黎丹戎，等.大黄素对乏氧鼻咽癌细胞的放射增敏性与 DNA修复基因的关系［J］.中国药理学通报，2009，25(3):348－52.

［2］ Liu Y，Hou H X，Li D R，et al.Correlation of enhancement radiosen-sitization of emodin isolated from Guangxi P.multiflorum Thunbon hypoxic nasopharyngeal cancer cells with expression of DNA repair genes［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(3):348 －52.

［3］ 张驰宇，徐顺高，黄新祥.一种新颖简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法的建立［J］.生物化学与生物物理进展，2005，32(9):883－8.

［3］ Zhang C Y，Xu S G，Huang X X.A novel and convenient relative quantitative method of fluorescence real time RT-PCR assay based on slope of standard curve［J］.Progr Biochem Biophys，2005，32(9):883－8.

［4］ 马 泰，孙国平，李家斌.细胞自噬的研究方法［J］.生物化学与生物物理进展，2012，39(3):204－9.

［4］ Ma T，Sun G P，Li J B.Methods for autophagy detection［J］.Progr Biochem Biophys，2012，39(3):204 －9.

［5］ Jung C H，Jun C B，Ro S H，et al.ULK-Atg13-FIP200 complexes mediate mTOR signaling to the autophagy machinery［J］.Mol Biol Cell，2009，20(7):1992 －2003.

［6］ Kim J，Kundu M，Viollet B，Guan K L.AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1［J］.Nat Cell Biol，2011，13(2):132 －41.

［7］ Chakrama F Z，Seguin-Py S，Le Grand J N，et al.GABARAPL1(GEC1)associates with autophagic vesicles［J］.Autophagy.2010，6(4):495 －505.

［8］ Yang C ，Kanshal V，Shah S V，Kaushal G P.Autophagy is associated with apoptosis in cisplatin injury to renal tubular epithelial cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2008，294(4):777 －87.

［9］ Scarlatti F，Maffei R，Beau I，et al.Role of non-canonical Beclin1-independent autophagy in cell death induced by resveratrol in human breast cancer cells［J］.Cell Death Differ，2008，15(8):1318－29.

［10］ Sadasivan S，Dunn WA Jr，Hayes R L，Wang K K.Changes in autophagy proteins in a rat model of controlled cortical impact induced brain injury ［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，373(4):478－81.