陈冬莲，侯华新，郑 华，梁 燕，黎丹戎

(广西医科大学药学院，广西南宁 530021)

越来越多的研究表明自噬在肿瘤发生发展中起着重要作用，且肿瘤的放化疗过程可诱导细胞发生自噬性死亡，如Peng等［1］在研究小檗碱对A549放射增敏作用过程中发现放射增敏与细胞自噬能力之间有着紧密的联系。本课题前期实验已证实广西产何首乌中无细胞毒作用浓度5 mg·L－1大黄素联合2Gy射线照射对鼻咽癌细胞CNE-1具有明显的放射增敏作用，放射增敏比为 1.39［2］，为了研究大黄素在放射增敏过程中是否伴随着自噬的发生及其作用机制，本实验通过电镜观察大黄素在放射增敏过程鼻咽癌细胞CNE-1自噬体形成的超微结构变化，real-time PCR定量检测自噬相关基因的表达，探讨放射增敏与自噬发生的关系。

1 材料

1.1 细胞来源 人鼻咽癌高分化CNE-1细胞由广西医科大学实验中心提供。

1.2 主要试剂 大黄素由课题组前期从广西何首乌分离获得并经结构鉴定，纯度为99%。实验中加入无细胞毒作用浓度5 mg·L－1。TRIzol REAGENT(Invitrogen公司，美国)、异丙醇和三氯甲烷为国产分析纯试剂、DEPC处理水、RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司，美国)、Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche公司出品)、灭菌注射用水、RPMI 1640(Gibco公司)

1.3 主要仪器 超低温高速离心机5810 R(德国Eppendorf公司)、ABI 7300 Real-time PCR 仪、Nano Drop 2000(Thermo公司)、凝胶成像仪(BIO-RAD)、倒置相差荧光显微镜Axiovert 200。采用60Co射线(加拿大Theratronics产品)为照射源，剂量率94.41 cGy·min－1，根据实验要求进行相应剂量的照射。

1.4 引物序列 根据 NCBI数据库提供的人ULK1、GABARAPL1、Beclin1、Bcl-2 核酸序列，设计特异PCR引物，以β-actin作为内参照，引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成，其引物序列及产物大小见Tab 1。

Tab 1 Primer sequences and product lengths

2 方法

2.1 细胞培养 细胞于37℃ 体积百分数为5%CO2培养箱内，以含体积百分数为10%小牛血清的RPMI 1640培养液在培养瓶内单层传代培养，取对数生长期细胞进行实验。……