刘丽敏，刘华钢

(广西医科大学药学院，广西南宁 530021)

氯化两面针碱(nitidine chloride，NC)是从广西特有药用植物两面针［Zanthoxylum nitidum(Roxb)DC］的根中分离到的具有抗肿瘤活性的生物碱，本课题组前期的研究结果表明NC能抑制多种肿瘤细胞的生长，给药剂量为10 mg·kg－1时NC对人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤的抑瘤率为60.91%，与环磷酰胺疗效相近［1－2］，具有较强的体内外抗肿瘤活性。为了进一步揭示其抗肿瘤机制，我们利用基因芯片研究了NC治疗肝癌后一些相关基因表达的改变，了解NC在基因调控网络中的影响，以期筛选NC的相关作用靶点，更全面探讨NC针对肝癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 NC由广西中医药研究院赖茂祥研究员分离提纯(纯度＞95%)，Human OneArray表达谱芯片由上海康成生物工程有限公司提供(Phalanx array);TRIzol试剂、Super ScriptryⅡRNase逆转录酶、dNTP:美国Invitrogen;cDNA标记试剂盒、NucAway柱:Ambion公司;单荧光标记CyDye:Amersham;EB:Sigma公司;DEPC:Amresco公司;琼脂糖:加拿大BBI公司;RNA later:华氏生物技术有限公司;氯仿、异丙醇、无水乙醇:广州新港公司;cDNA合成试剂盒、SYBR Green qPCR Kit:TaKaRa;PCR扩增引物为TaKaRa公司产品。

1.2 基因芯片检测

1.2.1 标本处理 基因芯片分析所用的肿瘤组织样品为本课题组前期建立的肝癌HepG2裸小鼠移植瘤模型［1］，NC 2.5、5 和 10 mg·kg－1剂量对肝癌HepG2的抑制率分别为 12.06%、35.63%和60.91%［1］。生理盐水组和NC高剂量组各取瘤块，生理盐水冲洗。切至厚度在0.5 cm以下，长约1 cm，放入装有5倍体积RNA later的冻存管中。4℃孵育过夜，然后转入－20℃中保存待用。

1.2.2 总RNA样品制备及双链cDNA合成 TRIzol法抽提肝癌组织标本总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA质量、样品浓度及总量，获得的RNA溶液保存于－80℃。以纯化后的RNA为模板，根据cDNA合成试剂盒的操作手册合成cDNA的第1链和第2链。

1.2.3 aRNA合成、纯化及标记 按照试剂盒说明操作，标记好的aRNA被收集在1.5 ml离心管中。未标记的染料留在柱子中。去掉柱子，测OD值，确定标记效率。使用NanoDrop ND-1000测定标记后aRNA的浓度以及纯度，其中OD260/280值应该在1.8～2.1之间。标记上CyDye的aRNA的浓度比上总的aRNA的浓度即为aRNA标记效率，标记效率＞9，标记效率合格。

1.2.4 芯片杂交及检测 杂交好的芯片干燥后经GenePix 4000B扫描仪扫描，软件Imagequant 5.0将图像转化为基于荧光强度的数字信号显示。将图像导入图像分析软件OneArray GenePix Array List，自动寻点，手工微调。扫描仪自动开始分析，以阴性对照点杂交信号为参照，大于阴性对照点平均信号强度加上3倍的阴性对照标准偏差［＞Average(blank)+3SD(blank)］的杂交信号作为有效杂交信号。数据导入分析软件，Ratio值通过LOWESS方法归一化，表示每个基因点的杂交信号强度比值，或者是基因表达量在实验组和对照组间的变化倍数(大于1代表相应基因表达量上调倍数，小于1代表相应基因表达量下调，其倍数用1除以该数值表示)。判断标准Ratio大于1.5或小于0.67作为有效表达变化的基因数据。将分析结果导入Excel表，进行下一步分析，包括数据的预处理和归一化、差异表达基因分析、芯片数据的统计学分析、聚类分析等。

1.2.5 实时荧光定量PCR验证 采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术对部分差异基因(3个下调基因、1个上调基因)的表达水平进行了验证。

1.2.5.1 总RNA样品制备及双链cDNA合成 同“1.2.2”。生理盐水组和NC高剂量组各取6个样本。

1.2.5.2 引物的设计和合成 参照文献并从Gene Bank查找 TOP1、TOP2、IL-8、RTEL 及内参 GAPDH基因的全序列，再根据荧光定量PCR引物设计的基本原则，用Primer 5.0软件设计，引物由TaKaRa公司合成。引物序列如Tab 1所示。

Tab 1 Real-time PCR primer sequence

1.2.5.3 Real-time PCR扩增及结果计算 建立一个25 μl的反应体系，2 ×SYBR Premix Ex TagTM12.5 μl，上下游引物各 0.5 μl，cDNA 溶液 2 μl，ddH2O 4.5 μl，优化的PCR反应条件为:95℃预变性5 min，再 95℃ 变性 10 s，59℃ 退火 15 s，72℃ 延伸(收集荧光)20 s。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续从72℃缓慢加热到95℃(每0.5℃读板一次)。各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由仪器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。

2 结果

2.1 基因表达改变的总体分析 数据分析显示:在所检测的30 968个基因中，NC处理组与生理盐水组比较，发现有差异表达基因共有369个，其中上调基因183个，下调基因186个。我们在对这些表达差异基因进行分类时发现许多基因具有多种功能，参与多种细胞活动过程，涉及到细胞因子和生长因子受体和核受体、细胞凋亡、分化、细胞周期/周期素、蛋白降解、DNA损伤/修复、离子通道、信号传导、转录/转录因子、细胞粘连等多个方面。差异基因影响的信号通路主要有泛素介导的蛋白质水解、细胞核受体、转化生长因子及其受体信号通路、IL-3信号通路、细胞周期信号通路、钙离子信号通路等。

2.2 部分表达差异的基因 我们从差异表达基因最多的细胞增殖与凋亡调控、细胞周期、肿瘤免疫相关等几个方面筛选出部分基因，并对其功能进行简单分析。由于篇幅所限，本文中仅列出部分与凋亡及细胞周期调控相关的基因，见Tab 2。

2.3 Real time PCR验证部分差异表达基因的表达水平 采用GAPDH内参校正后样品相对含量见Fig 3，其中3个基因的表达水平均低于对照组，一个基因的表达水平高于对照组，表达的改变与芯片研究结果具有一致性。

3 讨论

肝癌的发生是一个复杂的过程，其表达谱与正常肝细胞相比有很大差别，其中表达增加的基因数目少于表达降低的基因数目，推测与癌细胞的功能简单化有关，核糖体相关蛋白表达的降低也证明这一点［3－4］。我们在对NC作用后的差异表达基因进行聚类分析时发现有许多基因具有多种功能，参与多种细胞活动过程，涉及到细胞凋亡或肿瘤相关、结合蛋白相关及信号传导、转录、翻译等多个方面。结合基因表达状态与功能分析，发现以下一些较为明显的现象。

NC作用后Bcl-2家族的Bcl-w基因表达下调，Bcl-w这个基因在人和鼠是高度保守的，类似Bcl-2和Bcl-x，Bcl-w参与调控许多种细胞的凋亡，促进细胞存活，也是一个原癌基因［5］。研究者使用免疫组织化学法分析61例肺腺癌病例，显示Bcl-w过表达与肿瘤分期、分化程度相关，并倾向于伴随预后不良。用小分子RNA干扰技术下调Bcl-w表达明显地抑制HUT29细胞的生长，但对抗癌药物引起的细胞死亡无效。Bcl-w的过表达促进非小细胞肺癌尤其是肺腺癌的生长，可能是一个治疗的靶点［6］。Bcl-w还是肝特异性的小分子RNA(miRNA)——miR-122的直接作用靶点，对肝细胞癌株Hep3B和HepG2，miR-122通过直接的靶向结合Bcl-w的3'-UTR区，调节Bcl-w的表达，使胞内的 Bcl-wmRNA和蛋白水平被抑制，并引起细胞存活率下降和caspase-3激活［7］。Bcl-2蛋白家族调节细胞凋亡的机制与线粒体密切相关。Bcl-2和Bcl-X1抑制细胞凋亡的部分原因是阻断了细胞色素C(Cyto C)从线粒体释放，Cyto C是凋亡蛋白酶激活的关键因素。Bcl-2可以直接或间接阻止Cyto C释放，但不是唯一功能［8］。目前Bcl-w抑制细胞凋亡的具体机制是否也与线粒体有关尚未清楚。NC抑制Bcl-w基因的表达，促进肿瘤细胞凋亡，可能有利于提高肿瘤细胞对药物的敏感性。

Tab 2 Differentially expressed genes in HepG2 cells after treatment of NC

Tab 3 Relative amount of mRNA in tumor organization treated by NC(±s，n=6)

Tab 3 Relative amount of mRNA in tumor organization treated by NC(±s，n=6)

group RTEL1/GAPDH TopoⅠ/GAPDH TopoⅡ/GAPDH IL-8/GAPDH Control 1.68E-01 2.36E-01 1.56E-01 6.60E-03 NC 1.02E-01 7.31E-02 1.30E-01 1.08E-02

其他与细胞凋亡调控和功能相关基因(如IHPK2、AMID、RTEL1)也有不同程度的变化，其中上调的基因IHPK2(inositol hexaphosphate kinase 2)即六磷酸肌醇酯激酶2，又名PiUS;IP6K2，该基因编码的蛋白属于肌醇磷酸激酶(IPK)家族，1998年被克隆出来，定位于人染色体的3p 21.3，认为它可能是细胞磷(体内)平衡的重要调节器［9］。Morrison等［10］为了研究干扰素IFN-β诱导凋亡的机制，采用反义技术敲除基因来辨别引起细胞死亡的基因产物，并分离了几个干扰素-诱导死亡的调节子(RIDs)，其中一个是IP6K2，并鉴定了IP6K2是一个凋亡的正调节蛋白，IP6K2的过表达强化了 IFN-β和细胞毒剂对卵巢癌细胞的诱导凋亡作用。IP6K2的表达致敏肿瘤细胞，未受照射的NIH-OVCAR-3细胞转染了IP6K2后形成克隆减少。IP6K2的过表达引起放射敏感性增加，表现为集落生成单位(CFU)减少。IFN-β和辐射都能诱生caspase-8，在IP6K2表达的细胞，Caspase-8 mRNA的诱导更明显，资料显示IP6K2的过表达强化了卵巢癌对放射和IFN-β的敏感性，IP6K2可能有利于增强细胞受损后caspase-8和死亡受体DR4的表达和(或)功能，IFN-β和γ辐照诱导凋亡，通过外部的、受体介导的的途径，这两个死亡诱导物都受 IP6K2的正调节［11］。此后Morrison等又进一步研究了IHPK2生长抑制和增强凋亡的机制，证实了IHPK2与TNF受体-伴随的因子(TRAF)2结合及干扰了转化生长因子β-活性激酶1(TAK1)的磷酸化，藉此抑制NF-κB信号。IHPK2包含2个与TRAF2结合的必需位点:Ser-347和Ser-359。与野生型IHPK2转染的细胞相比，表达S347A和S359A突变的细胞在IFN-α作用后显示出3到5倍的TAK1激活作用，这个突变体在IFN-α作用后，与野生型 IHPK2-表达的细胞相比，在NF-κBDNA结合方面表现出6到10倍的增强，而野生型IHPK2-表达的细胞NF-κB的DNA结合是被抑制的［12］。研究者认为IHPK2-TRAF 2结合引起TAK1和NF-κB介导的信号的衰减，可能是IHPK2细胞凋亡活性的部分原因。NC作用后IHPK2表达上调，有利于增强细胞凋亡。

在以前的研究中我们已证实，NC可能作用于细胞的G2/M调控点，表现出G2/M期阻滞作用，从而影响细胞的分裂增殖。NC可能会通过作用于G2/M期调控因子cyclinB1和cdc2，影响其mRNA水平及其蛋白表达［13］。基因芯片的结果发现NC作用后HepG2细胞的PR48、MTSS1基因表达上调，cyclin T2基因表达下调，其可能主要在细胞周期调控和DNA修复起作用。cyclin T2属于高度保守的细胞周期素家族(cyclin family)，主要参与调节基因的转录。cyclin T2与周期素依赖激酶9(CDK9)结合形成 CDK9/cyclin T2复合物［14］，这个复合物是人类基因转录延伸因子P-TEFb的亚单位，它能磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)最大亚基的羧基端结构域，激活PolⅡ的转录功能，抑制CDK9/cyclin T2的激酶活性，对PolⅡ催化的基因转录起负调控作用，其中包括HIV-1tat启动子控制的基因转录反应［15-16］及基因转录偶联修复功能，后者是指DNA修复效率与基因转录状态有关，处于转录活跃状态的基因的DNA损伤修复比沉默基因的修复效率要高，基因转录链的修复效率比非转录链的要高，这种修复反应是由有关DNA修复蛋白和某些转录因子共同完成。当细胞DNA受到损伤时，如果DNA损伤得到修复后细胞周期进程重新继续。另一种修复损伤细胞的发生机制就是通过凋亡过程消灭它们。cyclin T2基因表达的下调，说明NC可能通过抑制cyclin T2介导的DNA转录、偶联修复功能，导致细胞周期阻滞。

MTSS1基因又名MIM(Missing in metastasis)，是控制细胞生长和发展的重要调节因子，对细胞周期的发展起负调控作用。MTSS1的过表达抑制细胞增殖，其表达受其启动子区内CpG岛DNA甲基化的调节，但MTSS1的表达水平与p53的功能状态无关［17－19］。Ma 等［20］研究了 MTSS1 在肝脏肿瘤发展中的作用，发现在肝细胞癌临床患者中，MTSS1的基因和蛋白表达水平上升。它的表达明显与早期病理学国际恶性肿瘤标记符号阶段分组、肿瘤包裹、缺乏静脉浸润相关。发现更高的MTSS1表达与疾病的早期阶段相关，MTSS1的表达可能影响肝细胞癌的发展并可能是疾病早期阶段的一个有力标志。

除此之外，NC作用后与分裂/增殖相关的基因MIG6、TBCE表达明显上调，而另一类与生长因子相关的基因如GRB7、CDH2、LAMA1等表达下调，提示NC可能通过某些机制抑制有丝分裂从而影响肿瘤细胞增殖。肿瘤免疫相关的基因CCL5、IL-8上调，IL-15、IFNE1、COX4I1下调。此类诱生的细胞因子可能通过诱导NK细胞增殖，增强NK细胞的活性，诱导LAKC和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，并刺激他们产生细胞因子，发挥广谱的肿瘤杀伤活性。肿瘤免疫相关的基因可能在NC对癌细胞的生长调节中也发挥着重要作用。

综上所述，NC作用于肝癌的基因调控是一个多基因、多环节、多途径参与的过程。上述基因的改变为阐明NC诱导肿瘤细胞凋亡、细胞G2/M期周期阻滞的机制提供了很好的理论依据。但由于基因芯片上的基因是已知，而很多基因的功能目前尚未研究清楚，还受到基因表达与调控滞后的影响，如何解释这些基因同时变化还有相当大的难度;并且基因表达不能完全代表其产物的功能，基因表达的结果是产生相应的蛋白质和酶，才能实现其各项生理功能，而基因与蛋白质功能并非完全平行。因此基因芯片的检测只是第一步，只是提供了进行药物作用机制全面分析的一个初步信息，对于已经初步获得的差异基因，需做进一步分析验证，还需要与其他检测蛋白质和酶的实验方法相结合，以充分发挥基因芯片高通量的优势。

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