万 东，祝慧凤，罗 勇，谢 鹏

(1.重庆医科大学附属第一医院急诊科，重庆 400016;2.西南大学药学院暨中医药学院，重庆 400716;3.重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆 400016)

脑卒中后，受损神经环路修复和重建奠定了神经缺失功能恢复的结构基础。梗死灶周围大脑皮质(peri-infarction cortex，PIC)幸存神经元树突重塑、轴突再生和突触重构是神经环路重建最关键的可塑性事件。迄今，神经修复药物极其匮乏，Ⅲ期临床试验中，仅发现胞磷胆碱对卒中后受累肢体功能恢复有促进作用［1］。

梓醇是地黄主要的有效单体成分，具有确切的神经保护作用［2］和促神经修复潜能。课题组前期研究表明梓醇能够促进离体培养鼠脑皮质神经元轴突生长［3］;上调缺血性脑卒中大鼠PIC区轴突生长相关蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)蛋白表达［4］，增加 PIC 区神经毡内突触数目［5］，改善模型大鼠受累前肢感觉运动功能［6］，提示梓醇可促进卒中后轴突芽生和突触重构，有助于受损神经环路信号输出通道的修复重建。但梓醇能否诱导神经元树突生长，促进神经元信息接收通道和信号整合平台的修复重建目前尚未见相关报道。因此，本研究制备大鼠局灶缺血性脑卒中模型，观察梓醇对模型大鼠神经缺失功能恢复、PIC区神经元树突树复杂程度、树突棘密度以及突触素p38蛋白表达的影响，明确梓醇促脑卒中后神经修复作用，探讨其可能的神经机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 成年健康Sprague-Dawley大鼠57只，♀♂不拘，体质量(220－250)g，购自重庆医科大学实验动物中心(合格证号:检动字2002A040)。随机分为7组:假手术组，模型组，生理盐水组，梓醇低、中、高剂量组和胞磷胆碱对照组。

1.2 药品和器材 梓醇购于中国药品生物制品检定所(产品批号:110808-200508，规格:20 mg/支)。胞磷胆碱钠注射液为山西晋新双鹤药业有限责任公司产品(国药准字 H14021994，规格:125 g·L－1)。小鼠抗突触素单克隆抗体、兔抗突触素多克隆抗体、小鼠抗β-actin单克隆抗体、荧光素FITC标记羊抗小鼠IgG、碱性磷酸酶(AP)标记羊抗小鼠IgG、AP标记羊抗兔IgG以及BCIP/NBT显色试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。Koda显影液和Koda定影液由重庆医科大学校内“世强像馆”馈赠。Leica-cm1850型冰冻切片机、Leica VT1000S型振动切片机为日本岛津公司产品，垂直电泳槽、电泳仪、电转槽为Bio-Rad公司产品，图像扫描采用Scan-Maker E6系统，图像灰度测量采用4.5.1版Quantity one图像分析软件。

1.3 模型制备 参照文献［4，6－7］，采用颞侧低位开颅法电凝右侧大脑中动脉位于嗅束与大脑下静脉之间的一段，制备永久性大脑中动脉闭塞(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)模型。假手术组除不凝闭大脑中动脉外，其余操作同模型组。

1.4 模型成功的判断与纳入标准 术后24 h，采用Bederson评分［7］评估受累肢体神经缺失功能状况:0分，无神经功能缺失症状;1分，左前肢屈曲，但不伴有其他异常，即提尾悬空实验阳性;2分，提尾悬空实验阳性，同时侧推抵抗力下降(即侧向推力实验阳性)，但自由活动时无转圈行为;3分，同2分行为，且自由活动时向瘫痪侧转圈。评分为1～3分的大鼠纳入实验。

1.5 药物干预 梓醇低、中、高剂量分别为1、5、10 mg·kg－1，胞磷胆碱给药剂量为 0.5 g·kg－1。梓醇和胞磷胆碱均用生理盐水配制，每次给药总体积为3 ml。生理盐水组经腹腔注射等体积生理盐水。假手术组和模型组不给任何药物干预。于术后24 h首次经腹腔注射给药，每日1次，连续7 d。

1.6 神经行为学测试 参照文献［8］，采用角落实验于术前1 d测评各实验组大鼠躯体转向偏好，术后1 d(给药前)、4、7和15 d评价感觉运动整合功能和姿势不对称运动。将两块大小为30 cm×20 cm×0.5 cm的硬纸板制作呈30°夹角的狭窄通道，两块纸板前端不完全接触，保留0.5 cm的缝隙。行为评定时，将大鼠置于两块纸板中间的通道上，嘴侧朝向角顶。将夹板从大鼠嘴侧向尾侧缓慢移动，使两块硬板同时触及大鼠双侧的胡须。大鼠受到来自两侧的刺激后，会直立身体，向左或向右转身。正常大鼠左转身和右转身次数基本相同;而脑卒中大鼠受肢体偏瘫的影响，向病灶侧(本研究为右侧)转身的次数明显增加。每次测评时每只鼠观察10次，记录右转身次数并进行统计分析。

1.7 脑梗死体积测定 参照课题组前期方法［9］，采用磁共振成像(MRI)检测大鼠脑梗死体积。于pMCAO术后1 d(给药前)和15 d时，采用TOSHIBA VISART 1.5T超导核磁共振成象仪，选用膝正交线圈(QD)，行头颅T2WI扫描。测量各组大鼠脑梗死绝对体积占对侧大脑半球体积的百分比，即相对脑梗死体积。

1.8 Golgi-Cox染色 依据文献介绍［10］，配置Golgi-Cox溶液，避光静置1 d后使用。术后15 d，假手术组、模型组、生理盐水组、梓醇中剂量组和胞磷胆碱组各取3只大鼠，深麻醉后断头取脑，去除大脑额极部分，采用悬吊法将脑组织块悬吊于100 ml Golgi-Cox溶液中，室温避光静置14 d后取出脑组织块，转入30%蔗糖溶液中浸糖2～5 d。采用振动切片机制备厚为100 μm的脑片，用Leica-cm1850型冰冻切片机制备厚度为60 μm的脑片。收集所有的脑片，采用飘浮法完成脑片显影和定影。蒸馏水漂洗10 min后，裱片、干燥、常规脱水、透明、封片。显微镜下观察并采集图像。

1.9 神经元树突形态学观察分析 参照文献方法［11］，制定用于图像分析的神经元入选标准:(1)细胞定位明确，整体轮廓清晰，胞体和突起着色均匀一致;(2)单个神经元的大部分树突野清晰可辨，且聚焦在同一平面;(3)神经元的树突分支至少可以显示到3级或以上;(4)所选神经元不被其它神经元胞体、突起或血管遮挡。

在200倍光镜下观察PIC区距梗死灶边缘1.5～2.5 mm范围内大脑皮质锥体神经元树突分支，1 000倍油镜下观察神经元树突棘。每只大鼠采集20个锥体神经元的树突像以备图像分析。应用NIH ImageJ图像分析软件，调用“Neuron J”模块，采用Sholl分析法(Sholl Analysis)，计量每个神经元树突分支节点总数。树突棘密度用每10 μm长的二、三级树突分支上树突棘的个数表示。每只动物分析10个神经元。

1.10 免疫荧光组织化学法检测突触素蛋白表达术后d 15，每组取3只大鼠，深麻醉后用质量分数为4%的多聚甲醛200 ml灌流固定，采集视交叉前后2 mm范围的脑组织块(含运动皮质区)，用质量分数为4%的多聚甲醛4℃后固定过夜，转入质量分数为30%的蔗糖溶液脱水至组织块沉底，速冻后连续冠状位切片，片厚30 μm。脑片收集于0.02 mol·L－1PBS缓冲液中，用含0.3%Triton X-100(体积比)的0.02 mol·L－1PBS漂洗3次后，正常山羊血清工作液室温封闭30 min;转移脑片至小鼠抗p38单克隆抗体工作液中(稀释比例为1∶200)，4℃过夜(14～16 h);0.02 mol·L－1PBS漂洗脑片3次后，转移至FITC标记羊抗小鼠IgG工作液中(稀释比例为1∶100);37℃避光孵育1 ～3 h;0.02 mol·L－1PBS漂洗脑片4次后，裱片，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察并采集图像。阴性对照用0.02 mol·L－1PBS代替小鼠抗p38单克隆抗体工作液，其余步骤相同。

1.11 Western blot检测突触素蛋白表达 术后d 15，每组取3只大鼠，深麻醉后经心脏灌注生理盐水100 ml，断头取脑;冰上分离缺血灶周围残存大脑皮质，准确称量0.1 g，加入1 ml 4℃预冷的胞质裂解液［成分为蔗糖 0.5 mol·L－1、HEPES 10 mmol·L－1(pH 7.9)、MgCl21.5 mmol·L－1、KCl 10 mmol·L－1、EDTA 1 mmol·L－1、甘油 10%(V/V)、DTT 1 mmol·L－1、PMSF 1 mmol·L－1、Aprotinin 5 mg·L－1、Leupeptin 5 mg·L－1］，冰上匀浆，提取胞膜和胞质蛋白。Bradford法测定抽提物中蛋白浓度。SDS-PAGE分离含40 μg蛋白的胞膜及胞质抽提物;电泳结束，电转蛋白至PVDF膜;TTBS洗膜后，用兔抗p38多克隆抗体(稀释比例为1∶200)和小鼠抗β-actin单克隆抗体(稀释比例为1∶500)混合一抗工作液孵膜，4℃过夜(16～18 h);TTBS洗膜4次后，用AP标记的羊抗兔IgG(1∶15 000)和AP标记的羊抗小鼠IgG(1∶15 000)混合二抗工作液孵膜，37℃ 1 h;TTBS洗膜4次后，将膜片移入BCIP/NBT工作液中，避光显色5～10 min;终止显色反应后，用自来水漂洗膜片，自然晾干后扫描并采集图像。

1.12 半定量分析 免疫荧光组织化学染色切片置于荧光显微镜下观察，每只大鼠观察3张完整无损的脑片，200倍镜下观察和拍摄每张脑片PIC区阳性细胞分布密集的3个不同视野，图像转为灰度模式后，采用NIH ImageJ图像分析软件测定p38阳性着色区域积分光密度值(IOD)。取同一切片背景染色定标，以减少非特异性染色和图像采集过程中荧光参数变化影响荧光强度所造成的误差。用各组3只大鼠共计9个视野的p38阳性着色区域平均IOD值进行统计分析。

Western blot膜片用ScanMaker E6系统扫描，并用Quantity one 4.5.1版图像分析软件(Bio-Rad公司产品)测定p38和内参β-actin蛋白各显色条带的累积光密度值(IOD值)，计算p38与对应的β-actin蛋白显色条带IOD值的比值，表示p38相对表达量。

2 结果

2.1 梓醇对大鼠感觉运动功能恢复的影响 角落实验显示，pMCAO术前各实验组大鼠左转次数为4.8±0.3，右转为5.2±0.3，躯体转向偏好组间差异无显著性(P＞0.05)。术后1 d(给药前)和4 d，除假手术组外，各实验组大鼠出现明显的神经功能缺失，右转次数明显增加，组间差异无显著性(P＞0.05);术后7 d和15 d，梓醇各剂量组和胞磷胆碱组神经缺失功能明显恢复，较对应时点模型组和生理盐水组右转次数明显减少，组间差异具有显著性(P ＜0.05)，见 Tab 1。

Tab 1 Numbers of right turns in the corner test among experimental groups(±s，n=6)

Tab 1 Numbers of right turns in the corner test among experimental groups(±s，n=6)

*P＜0.05 vs model group and normal saline group，respectively

Group Days after pMCAO 1 d 4 d 7 d 15 d Sham operation 5.2 ±0.3 5.5 ±0.2 5.3 ±0.3 5.4 ±0.5 Model 9.6 ±0.6 9.5 ±0.5 9.2 ±0.8 9.0 ±0.7 Normal saline 9.7 ±0.5 9.5 ±0.6 9.4 ±0.5 8.8 ±0.4 Low dose of catalpol 9.7 ±0.3 9.6 ±0.7 8.6 ±0.4* 8.0 ±0.3*Middle dose of catalpol 9.8 ±0.6 9.4 ±0.5 8.4 ±0.7* 7.5 ±0.5*High dose of catalpol 9.8 ±0.7 9.2 ±0.8 8.0 ±0.4* 7.0 ±0.8*Citicoline 9.6 ±0.8 9.4 ±0.7 8.5 ±0.6* 7.8 ±0.4*

2.2 梓醇对大鼠脑梗死体积的影响 MRI显示，假手术组未见脑梗死灶，pMCAO大鼠缺血病灶累及右侧大脑半球前肢感觉运动皮质和纹状体。术后1 d和15 d，各实验组脑梗死体积差异无显著性(P＞0.05)，见 Fig 1。

Fig 1 Lesion volume among groups(±s，n=6)

2.3 梓醇对PIC区神经元树突生长的影响 改良Golgi-Cox染色方法较稳定可靠，各组大鼠大脑标本均染色成功。镜下见大脑皮质神经元胞体、轴突、轴突分支、树突、树突分支和树突棘着色均匀，形态清晰可辨。图像分析结果显示，各实验组PIC区神经元排列紊乱，树突分支和树突棘密度较假手术组明显减少(P＜0.05);梓醇组神经元树突分支较模型组和生理盐水组均明显增加(P＜0.05)，趋于假手术组水平(P＞0.05);胞磷胆碱组树突分支数大于模型组，但差异无显著性(P＞0.05)，且明显少于梓醇组(P＜0.05)。各实验组树突棘密度变化趋势与树突分支的变化趋势相似。提示脑缺血后PIC区神经元树突分支和树突棘密度均明显减少;梓醇可促进神经元树突分叉，增加树突棘密度，见Fig 2。

2.4 梓醇对PIC区突触素(p38)蛋白表达的影响免疫荧光组织化学染色显示，突触素(p38)被FITC标记，阳性着色部位呈大小较均匀的绿色小点或颗粒，主要分布在神经毡内;部分阳性颗粒围绕在神经元周围，衬托出神经元胞体的轮廓;部分神经元胞质内可见大量颗粒状免疫反应产物。图像分析显示，梓醇中、高剂量组p38阳性着色部位IOD值均明显高于模型组和胞磷胆碱组(P＜0.05)，见Tab 2，Fig 3;Western blot检测结果与此基本一致，见Fig 4。提示梓醇可上调脑缺血后PIC区p38蛋白表达。

Fig 2 Golgi-Cox staining shows the changes in dendritic branches and spine density of the survival pyramidal neurons in PIC among experimental groups

Fig 3 Protein expression of P38 in the PIC among groups(FITC labelling，200×)

Tab 2 Integral optical density(IOD)of immunoreactiveproducts of p38 in the PIC among experimental groups(±s，n=3)

Tab 2 Integral optical density(IOD)of immunoreactiveproducts of p38 in the PIC among experimental groups(±s，n=3)

▲P＜0.05 vs sham operation;△P＜0.05 vs model;◆P＜0.05 vs normal saline;◇P＜0.05 vs Citicoline

Groups Value of IOD Sham operation 35611.51 ±2564.30 Model 32869.38 ±2769.17 Normal saline 34451.26 ±3392.86 Citicoline 38545.42 ±3592.01 Low dose of catalpol 39381.25 ±4656.33△Middle dose of catalpol 54826.05 ±1566.24▲△◆◇High dose of catalpol 63940.72 ±5127.41▲△◆◇

Fig 4 Western blot analysis of the protein expression of p38 in the PIC among groups(±s，n=3)

3 讨论

缺血性脑卒中后，PIC区和对侧大脑半球功能相似脑区神经元轴突再生、树突芽生和突触重构奠定了受损神经环路修复重建的解剖学基础［12］，直接关系到神经功能恢复状况。但目前还缺少有效的治疗药物促进这些可塑性事件的发生。

本研究采用角落实验观察到，永久性脑缺血后24 h，延迟给予梓醇或胞磷胆碱干预均能促进模型大鼠感觉运动整合功能的恢复。已有研究证实［8］，角落实验能客观评估脑缺血模型动物慢性期的神经缺失功能，脑缺血后90 d仍能检出感觉运动功能异常，检验效能和信度均高，优于神经功能评分和足失误实验。同时，头颅MRI检测证实，延迟给予梓醇干预并未有效缩小脑梗死体积，未显示出缺血脑保护作用，提示梓醇很可能通过神经保护以外的其他药理作用机制(如促神经修复等)发挥治疗作用。

基于此，本研究采用Golgi-Cox染色发现，脑缺血损伤后15 d，缺血灶周围幸存锥体神经元树突分支和树突棘密度均比假手术组明显减少，证实脑缺血对神经元树突产生了明显损害。梓醇组PIC区锥体神经元树突分支数目和树突棘密度均比模型组明显增加，提示梓醇可明显促进脑缺血后神经元树突生长，增强树突可塑性。树突是神经元接收、加工和整合输入信息的基本部位。脑缺血后，神经元树突分支和树突棘密度减少，阻碍了神经元信息传入，致使神经元之间的信息传输和细胞水平的信号整合发生障碍，是脑缺血损伤后出现神经功能障碍的重要原因［11，13］。树突芽生和树突棘密度增加可以提供更多表面进行突触发生，接受更多的轴突终末，有利于已有突触连接的细胞间形成更多的突触，或在以前没有突触连接的细胞之间建立新的突触连接，有助于病灶周围区神经元突触信号的传入、处理以及受损神经环路的修复和重建;并可有效阻止PIC区失去联系的幸存神经元因长期无法和其他细胞建立联系而发生凋亡。可见，增强树突可塑性可能是梓醇促进脑缺血大鼠神经功能恢复的重要神经机制。

突触是神经细胞间相互联系传递信息的结构基础，是神经环路的基础结构与功能单位，也是脑缺血损伤的敏感部位。脑缺血后受累神经元突触数量减少，效能降低，神经环路信息传递障碍是脑缺血后出现神经功能障碍的另一重要因素［11］。突触素p38是突触囊泡的特异性糖蛋白，主要定位于突触前终末内，常作为突触重构的重要分子标志之一。树突是神经元之间形成兴奋性突触的位置，树突棘密度增加常常伴随新的突触形成和功能改善。梓醇促进树突生长，增加树突棘密度的同时是否伴随突触重构能力的增强非常值得探讨。因此本研究采用免疫荧光组织化学染色和Western blot检测了PIC区突触素p38蛋白表达，结果发现脑缺血后15 d，梓醇组PIC区突触素p38表达明显强于模型组，与课题组前期研究结果相符［5］，表明梓醇可增强PIC区幸存神经元突触重构能力，有助于神经系统信息传递、加工和储存，这可能是梓醇促神经修复的另一神经机制。

此外，与既往相关报道一致［14－15］，本研究也证实胞磷胆碱可促进缺血周围区大脑皮质神经元树突芽生，上调突触素表达，有助于脑卒中大鼠神经缺失功能恢复，但作用不如梓醇明显。

总之，本研究表明，梓醇可促进脑缺血后病灶周围皮质神经元树突生长，增加树突棘密度，增强突触可塑性，为其促卒中后神经修复提供了客观的形态学依据，并可能成为有效促进卒中后神经修复的候选药物。

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