王 芳 尹利荣 孙 蓓

人类的机体时刻被来自外在和内在的多种微生物围攻，先天免疫系统可以抵抗一些潜在的病原体，这类具有抗菌活性的肽和微量蛋白的产物统称为抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs），AMPs是宿主先天免疫的一部分[1]。女性下生殖道为开放性腔道，当受到内源或外源性因素影响时，以乳杆菌等优势菌为主要组成的微生态系统很容易发生改变，导致疾病的发生[2]。本研究通过构建AMPs中防御素5（HD5）和LL37的真核重组质粒，并瞬时转染人阴道上皮细胞，以期探讨阴道上皮细胞抵抗微生物感染的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 pcDNA3.1（+）表达质粒购自Invitrogen公司；pcDNA3.1（+）-EGFP表达质粒由天津医科大学内分泌研究所构建；T4连接酶、限制性内切酶EcoRⅠ、KpnⅠ、NotⅠ购自TaKaRa公司；KOD dash酶购自TOYOBA公司；pGEM-T Easy载体、质粒抽提试剂盒、M-MLV逆转录酶及RNA酶抑制剂为Promega公司产品；Oligo（dT）18购自上海生工生物工程有限公司；Trizol和细胞转染用Lipofectamine 2000试剂盒购自Invitrogen公司；氨苄青霉素、卡那霉素、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸钠（SDS）购自华美生物工程公司；β-巯基乙醇、琼脂糖、甘氨酸、溴化乙锭（EB）为美国Sigma公司产品；酵母提取物（Yeast Extract）、胰蛋白胨（Tryptone）、琼脂（Agar）、角质形成细胞无血清培养基（K-SFM）、胎牛血清、DMEM/F12培养基均为GIBCO公司产品。DNA快速纯化回收试剂盒，高纯质粒提取试剂盒均购自Biomega生物技术公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自PIERCE公司。大肠杆菌E.coli JM109菌株为天津医科大学内分泌研究所保存。人HD5定量酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒最小可测浓度为0.1 μg/L，人LL37定量ELISA试剂盒最小可测浓度为0.14 μg/L，以上2种试剂盒均购自瑞科生物技术有限公司。……