张亚娟，王亚楠，丁亚骏，何璐云，刘 鑫，康巧珍

(郑州大学生物工程系 河南郑州 450001)

支气管哮喘(bronchial asthma，简称哮喘)是一种慢性反复发作的、由多种细胞(尤其是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T细胞)和细胞因子参与的气道变态反应性疾病［1］，在抗原刺激时会引起支气管平滑肌收缩、腺体分泌增多和黏膜血管扩张，最终导致支气管管腔狭窄、呼吸困难，严重时导致死亡。目前哮喘的发病率和死亡率逐年增长，尚无根治的办法，严重困扰着人类的健康。关于哮喘发病机制的探索、哮喘新药的研究与开发、新治疗方法的评价都主要依赖于动物实验［2］。目前国外大多数选用BALB/c小鼠来构建哮喘模型，但由于国内外不同的实验条件，国外文献提及的哮喘模型建立方法在国内并不完全适用［3］。本实验结合了国内外文献的报道，通过控制实验动物条件、致敏方法等，建立了1个稳定的小鼠哮喘模型，以便于支气管哮喘的研究及治疗。

1 材料与方法

1.1 实验动物 4～6周龄，健康的雌性BALB/c小鼠16只(郑州大学动物实验中心提供)，随机分为两组，A组8只，为对照组，以生理盐水代替OVA(Grade V Sigma公司)致敏和激发;B组8只，为模型组，用OVA致敏和激发。

1.2 主要试剂与仪器 卵清蛋白OVA，氢氧化铝(Sigma公司)，402AI超声雾化器。

1.3 哮喘小鼠模型的建立

1.3.1 动物致敏:B组小鼠分别于第0天和第14天腹腔注射新配置的致敏液0.2 ml(每0.2 ml致敏液中含有OVA粉末10 μg，氢氧化铝粉末20 mg)致敏;A组小鼠用生理盐水代替致敏液，注射部位及剂量相同［4］。

1.3.2 动物激发:用生理盐水配制浓度为1% 的OVA溶液，即得雾化液。于第28～30天，将B组小鼠置于5 L自制密闭容器中，以雾化液雾化吸入激发(402AI型超声雾化器提供雾化动力)，使小鼠暴露在OVA气雾中，每天30 min;A组小鼠在相同条件下以生理盐水代替雾化液雾化吸入激发，实验中尤其要注意观察雾化过程中模型组小鼠出现的阳性反应:腹肌抽搐、呼吸急促、大小便失禁等［5］。

1.4 肺泡灌洗液收取及细胞分类计数 在最后1次雾化24 h后脱臼处死小鼠，消毒分离出气管，剪开气管，把2 ml注射器针头插入气管内并固定。每次注入生理盐水 0.8 ml，回抽，共2次(回抽率达 85%以上)［4］。将 BALF 于 1 200 r/min，4 ℃ 离心 10 min，离心两次，沉渣重悬后涂片行瑞氏－姬姆萨复合染色，然后进行白细胞分类计数。

1.5 肺组织病理切片的染色 在两组小鼠肺泡灌洗后取肺，并用生理盐水8～10 ml冲洗，福尔马林固定，进行HE染色。

2 结果

2.1 小鼠行为学观察 A组小鼠无症状;B组小鼠出现烦躁不安，弓背抓脸，呼吸急促，前肢缩抬，腹肌抽搐，大小便失禁，最后安静少动等症状。

2.2 BALF白细胞分类计数 BALF中白细胞总数和EOS计数见表1。A组小鼠BALF中EOS%(2.12 ±0.58)，B 组小鼠 BALF 中 EOS%(17.20 ± 4.19)，两组比较差异有统计学意义(t=9.52，P ＜0.001)。

表1 BALF中细胞总数和EOS计数

2.3 小鼠肺组织病理改变 肉眼可见模型组小鼠肺脏体积比对照组明显增大;肺脏表面肿胀，有暗红色充血区域，且充血区域形状不规则;组织切面有白色泡沫状的物质渗出。将肺组织切片行HE染色后，光镜下可看到支气管和其伴行血管周围有较多的炎症细胞浸润，气道上皮有多处断裂，基底膜增厚明显且形态不规则［6］。见图 1。

图1 小鼠肺组织切片的光镜观察(HE染色，×100)

3 讨论

支气管哮喘是一种严重的呼吸道过敏反应性疾病，也是常见的威胁人类健康的慢性呼吸道疾病。目前全球支气管哮喘患者人数高达3亿多，且哮喘的发病率一直在上升，近10年来我国哮喘儿童人数上升了60%，引起了世界各国科研工作者的重视。因此，建立一种可靠的哮喘模型对研究哮喘的发病机制及治疗十分重要。

目前国内外报道的哮喘模型种类繁多，虽不能完全模拟人类哮喘的病理生理过程，但都产生了支气管哮喘的典型症状，如支气管上皮损伤、黏液过度分泌、肺内EOS% 增多、肺组织切片可见大量炎症细胞浸润等。本实验中，模型组小鼠在雾化激发期间出现了比较明显的哮喘急性发作症状;模型组BLAF中EOS%较对照组明显增加;病理表现具体为:肺组织水肿、腺体分泌增多、基底膜增厚、气管变形、气道上皮脱落、肺组织切片HE染色后可见大量炎症细胞浸润、尤其是嗜酸性粒细胞增多等表现［3］，符合哮喘的病理学特征。

以上结果表明，此模型能够用于哮喘的实验研究，此实验模型的构建对支气管哮喘的研究和治疗具有重要意义。然而对于此模型中存有的一些缺点和不足，需要在我们以后的研究和工作中不断地认识、改进和完善。

［1］原树云.哮喘患儿血清IL-10、IL-4与IgE水平的检测及意义［J］.河南医学研究，2009，18(1):16-18.

［2］Michelle M.Epstein.Are mouse models of allergic asthma useful for testing novel therapeutics［J］.Experimental and Toxicologic Pathology，2006，57(2):41-44.

［3］田代印，符舟，张燕，等.一种改良型小鼠哮喘模型方法的建立及评价［J］.重庆医科大学学报，2005，30(4):601-603.

［4］李美容，王敏.哮喘小鼠模型的建立与评价［J］.临床肺科杂志，2011，16(5):664-665.

［5］王妍，金先娇.支气管哮喘实验模型的研究进展［J］.国际呼吸杂志，2006，26(1):70-72.

［6］程晓明，王长征，李淑平，等.哮喘致敏小鼠模型的建立及脾脏CD4+T细胞的分离［J］.第三军医大学学报，2001，23(3):369-370.