董晓丽 明海霞 金 戈

(甘肃中医学院生理学教研室，兰州 甘肃 730000)

肌肽是继超氧化物歧化酶(SOD)和维生素E后又一被发现的天然非酶促自由基清除剂和抗氧化剂〔1〕。本研究用H2O2处理PC12细胞，制备氧化应激损伤致凋亡的模型，采用MTT法检测肌肽对PC12细胞增殖的影响，观察肌肽是否具有抗氧化应激的神经保护作用;检测肌肽对凋亡相关基因NF-κB P65 mRNA和蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠肾上嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)购于上海中科院生物细胞所;引物设计参考文献〔2〕，委托上海生工合成。L-肌肽购自吉尔生化(上海)有限公司、UNIQ-10 Trizol总RNA抽提试剂盒和AMV一步法RT-PCR试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司;小鼠抗大鼠NF-κB P65单克隆抗体、SABC、DAB试剂盒等购自武汉博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 PC12细胞经常规传代培养，培养基采用DMEM培养液，含10%热灭活超级新生牛血清、1%谷氨酰胺、青链霉素(100 U/ml)。37℃、5%CO2，饱和湿度下恒温培养箱中贴壁生长，每3天换液1次，1 w传代1次。

1.2.2 MTT比色法检测PC12细胞的增殖 取对数生长期的PC12细胞，制成单细胞悬液，按照1×104个/ml的密度接种于96孔板中，每组6孔，37℃孵育过夜后，弃去原培养液，正常组加入 DMEM完全培养基 100μl，损伤组加入终浓度为200μmol/L的H2O2，保护组加入H2O2前30 min加入肌肽，使肌肽终浓度分别为10，20，30 mmol/L。37℃孵育16 h，弃去药液和培养液，每孔加入MTT 25μl，继续孵育4 h，小心吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl，振荡10 min，用酶联免疫分析仪490 nm波长检测各孔光密度(OD)值，并计算生长抑制率。根据实验结果选择肌肽作用PC12细胞的最佳浓度。

1.2.3 RT-PCR检测NF-κB P65 mRNA的表达 将所需离心管、PCR反应管和微量吸头在0.1%EPC溶液中浸泡24 h，烤干后高压灭菌备用。……