覃红斌 魏 蕾 张京伟 唐军民

(湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000)

神经细胞内tau蛋白过度磷酸化，并由此形成异常的神经纤维缠结(NFTs)是AD的一个特征性病理变化〔1〕。神经元内正常的tau蛋白何以被磷酸化，并形成NFTs的确切病因和机制尚不清。Niemann Pick type C(NPC)病人脑同时存在胆固醇代谢失衡和NFTs，提示胆固醇与tau蛋白过度磷酸化可能存在某种联系〔2〕。研究发现胆固醇在神经缠结变的神经元中聚集〔3〕，支持细胞内胆固醇过载与tau蛋白磷酸化有关。本研究基于上述背景，通过观察大鼠海马胆固醇含量升高后tau蛋白磷酸化程度的变化，探讨其在AD中可能的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性SD大鼠(同济医学院动物中心，清洁级)，体重200～250 g，2～3月龄，常规环境饲养，随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组9只。

1.2 行为学检测 选取40只大鼠进行1 w的Morris水迷宫训练，遴选出36只成绩相近的大鼠进行后续实验，训练每天1次，每次3个象限。脑立体定位注射72 h后再次进行1次水迷宫检测，检测1个象限。

1.3 脑立体定位注射 SD大鼠称重，以5%水合氯醛0.6 ml/100 g腹腔注射麻醉，固定大鼠于脑立体定位仪上，使前后囟保持水平，头顶局部剃毛，消毒。头顶正中矢状切口长约1.5 cm，用骨膜分离器完全分离骨膜，使前后囟暴露。以前囟为零点定标:前囟后3.8～4.5 mm，中线旁开2.0 mm，用台式牙科钻在双侧海马各钻1孔，用10μl微量注射推进器缓慢注射。对照组注射0.9%Nacl，低剂量组注射2μg/ml胆固醇，中剂量组注射8μg/ml胆固醇，高剂量组注射20μg/ml胆固醇，总剂量均为10μl/只。进针至硬膜下约3.0 mm，缓慢注入，注射完毕后留针10 min，再缓慢退针，以防药物沿针道返回。缝合皮肤，局部涂布青霉素粉末，将动物置入笼内侧卧，待其苏醒。

1.4 组织总胆固醇含量的测定 麻醉动物并断头处死，迅速取出脑组织置于0～4℃生理盐水冲洗表面血迹，置冰盘中快速分离双侧海马，用分析天平准确称取海马组织，以800.0μl/50.0 mg的比例加入含2%SDS的磷酸缓冲液，冰浴匀浆，混匀30 s。取50μl移入离心管，然后加入100μl含2%SDS的磷酸缓冲液混匀。接着加入250μl氯仿∶甲醇(体积比2∶1)，混匀30 min，离心后吸取下层氯仿相，余下的溶液再次加入250μl氯仿/甲醇重复提取1次吸取下层氯仿相，两次氯仿相溶液合并，干燥。干燥后的沉淀加入30μl异丙醇∶聚乙二醇辛基醚(体积比2∶1)，旋涡震荡混匀2 min，再加入双蒸水45μl，旋涡震荡混匀2 min，该溶液即为待测液。待测液胆固醇的含量用胆固醇氧化酶-比色法(CHOD-PAP法)按照总胆固醇测定试剂盒说明书测定，总胆固醇测定试剂盒为上海荣盛生物技术有限公司产品。

1.5 免疫组织化学 用4%多聚甲醛溶液进行心脏灌注固定脑组织待取出脑组织后再在上述固定液中固定6～12 h，即可直接切片。免疫组织化学染色主要步骤参照说明书。DAB显色，常规脱水、透明、封片。

1.6 免疫印迹 麻醉动物并断头处死，迅速取出脑组织置于0～4℃生理盐水冲洗表面血迹，置冰盘中快速分离双侧海马，以1∶9的比例加入蛋白匀浆提取液，冰水中用1 ml匀浆器制成10%的蛋白匀浆，离心10 min，取上清备用。用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白含量，保证每泳道加入相同量蛋白。电泳结束后将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜。加入一抗tau-1(识别Ser-198/Ser-199/Ser-202非磷酸化位点，多克隆抗体，1∶1 000)、PHF-1(识别 Ser-396/Ser-404 磷酸化位点，单克隆抗体，1∶1 000)和R134d抗体(识别tau磷酸化和非磷酸化位点，多克隆抗体，1∶1 000)，以上抗体均购自 SAB公司，4℃过夜，加入荧光标记二抗，37℃孵育1 h，odyssey成像系统显色。1.7 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件行t检验及单因素方差分析。

2 结果

2.1 给药72 h后行为学测试 如表1所示给药72 h后水迷宫，对各组给药后潜伏期，穿越平台次数作单向方差分析，低剂量组有变化(P＜0.05)，中剂量，高剂量组较对照组变化明显(P ＜0.01)。

表1 各组给药后潜伏期变化(x ± s，n=9)

2.2 海马胆固醇含量 与对照组比较〔(0.60±0.40)mg/g〕，低剂量组略增高 〔(0.64 ±0.01)mg/g，P ＜0.05〕，中、高剂量组明显增高 〔(1.18 ±0.03)、(1.31±0.03)mg/g，P ＜0.01〕。

2.3 免疫组化结果 因背景色不一，以R134d标准化PHF-1与tau-1后，大鼠海马免疫组化染色结果显示:tau蛋白主要分布在大鼠海马CA3区，PHF-1染色显示随脑胆固醇含量增高，tau S396/S404位点磷酸化水平也随之增高，低剂量组有变化(P＜0.05)，中剂量组，高剂量组升高明显(P＜0.01)。tau-1染色显示随脑胆固醇含量增高，tau S198/S199/S202位点非磷酸化水平也随之降低，且中剂量组，高剂量组降低明显(P＜0.01)。R134d示总tau无明显变化(图1，表2)。

2.4 免疫印迹结果 双侧海马给药72 h后，大鼠海马免疫印迹结果显示:β-actin示上样无组内差异，以R134d标准化PHF-1与tau-1后，PHF-1染色显示随脑胆固醇含量增高，tau S396/S404位点磷酸化水平也随之增高，低剂量组有变化(P＜0.05)，且中剂量组，高剂量组升高明显(P＜0.01)。tau-1染色显示随脑胆固醇含量增高，tau S198/S199/S202位点非磷酸化水平也随之降低，且中剂量组，高剂量组降低明显(P＜0.01)。R134d示总tau无明显变化(图2，表3)。

图1 三种tau蛋白抗体的免疫组化(DAB，×200)

图2 三种tau蛋白抗体的免疫印迹

表2 三种tau蛋白抗体的免疫组化(n=9)

表3 三种tau蛋白抗体的免疫印迹(n=9)

3 讨论

本研究结果发现随胆固醇含量逐渐升高，tau去磷酸化程度逐渐降低，相反磷酸化程度逐渐升高，且动物的空间记忆能力也随脑胆固醇含量的升高而下降。高胆固醇水平能够促进脑内淀粉样前体蛋白(APP)经β分泌酶降解为β淀粉样蛋白(Aβ)〔4〕，在某些特殊的部位，胆固醇的更新非常活跃，如海马神经元突触后膜上的胆固醇，24 h内有20%以上被更新〔5〕，胆固醇在脑的代谢对脑细胞的生长、神经修复和重塑有重要作用。由此可见，胆固醇的含量对于学习和记忆的影响效果显著。虽然已知胆固醇在72 h内可以导致tau过度磷酸化，但也有另一项神经元培养研究显示，胆固醇水平的减少促进tau蛋白磷酸化〔7〕，对这种矛盾现象的解释是，tau蛋白磷酸化与细胞胆固醇量无关，而与细胞的特殊区域(如CRDs)有关，可能是该特殊区域传导着导致tau蛋白磷酸化的信号，这可能与胆固醇富载后神经元内相应的蛋白激酶和、或酯酶的变化有一定的关系，也有研究显示，胆固醇过少会抑制树突的延伸和突触的生成，并认为这可能与tau蛋白磷酸化有关〔7〕。研究已发现在诸多降低胆固醇药物中，他汀类(32羟基-32甲基-戊二酰辅酶A还原酶抑制剂)在对抗AD特异病理变化方面是最有效的〔8〕，但其具体机制还不清楚。胆固醇与AD关系的深入研究，可能会给AD治疗带来新的曙光，但还需要深入研究胆固醇在中枢神经系统的代谢机制。

1 龚成新，王建枝.tau蛋白在老年性痴呆症神经原纤维退行性变中的作用〔J〕.医学分子生物学杂志，2006;3(3):163-9.

2 Carstea ED，Morris JA，Coleman KG，et al.Niemann-Pick C1 disease gene:homology to mediators of cholesterol homeostasis〔J〕.Science，1997;277:288-31.

3 Fan QW，Yu W，Senda T，et al.Cholesterol dependent modulation of tau phosphorylation in cultured neurons〔J〕.J Neurochem，2001;76:391-400.

4 Sparks DE，Martin TA，Gross DR，et al.Link between heart disease，cholesterol，and Alzheimer's disease:a review〔J〕.Microsc Res Tech，2000;50(2):287-90.

5 Distl R，Meske V，Ohm TG.Tangle bearing neurons contain more free cholesterol than AD jacent tangle free neurons〔J〕.Acta Neuropathol(Berl)，2001;101:547-54.

6 Simons M，Keller P，Dichgans J，et al.Cholesterol and Alzheimer's disease:is there a link〔J〕?Neurology，2001;57(6):1089-93.

7 Masumura M，Hata R，Uramoto H，et al.Altered expression of amyloid precursors proteins after traumatic brain injury in rats:in situ hybridization and immunohistochemical study〔J〕.J Neurotrauma，2000;17(1):123.

8 Marx J.Alzheimer's disease:BAD for the heart，BAD for the mind〔J〕.Science，2001;294:508.