毛 东 付晓光 陆 航

(辽宁医学院附属第一医院胃肠外科，辽宁 锦州 121001)

胃癌的预后与癌组织浸润深度及是否发生了淋巴结转移 相关〔1〕。研究显示，肿瘤相关淋巴管的形成能够促进肿瘤的转移扩散〔2〕。因此当前有很多研究关注于如何抑制肿瘤环境下淋巴管的形成。VEGFR3是最先被验证的淋巴管生成的特异性标记物。VEGFR3是淋巴管内皮生长刺激因子VEGFC的特异性受体。VEGFC与VEGFR3结合后可引起淋巴管内皮细胞增殖、迁移及抑制内皮细胞凋亡，从而发挥促进淋巴管新生的作用。神经纤毛蛋白(NRPs)是一种跨膜糖蛋白，目前研究证明NRPs在肿瘤的生长转移中起着至关重要的作用〔3〕。最新研究表明NRP2参与了VEGFC诱导的淋巴管内皮细胞迁移和淋巴管新生(特别是与肿瘤相关的淋巴管功能性新生)功能，在肿瘤动物模型中阻断NRP2功能发现肿瘤转移至哨兵淋巴结和远隔器官减少的现象〔4〕。本实验将构建重组腺病毒载体介导的NRP2-shRNA基因沉默载体，转染胃癌细胞株SGC7901后检测该细胞中NRP2的表达情况以及NRP2-shRNA转染前后对于抑制SGC7901细胞的增殖、侵袭迁移的能力的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 胃癌细胞株SGC7901购自中国协和细胞库;RPMI1640培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司;Trizol试剂、RT-PCR试剂盒、Marker、限制性内切酶等均购自TaKaRa公司;Lipofectamine 2000、OPTI-MEM等购自Invitrogen公司;兔抗人NRP2单克隆抗体、二抗、β-actin内参照购自Santa Cruz公司;超纯质粒提取试剂盒、质粒小提试剂盒购自QIAGEN公司;RNAi干扰序列以及引物序列设计、合成由赛业(广州)生物科技有限公司完成，并统一构建到重组腺病毒系统pAdEasy-1上，同时携带GFP作为荧光示踪标记物，-80℃保存;干扰序列及分组见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 重组腺病毒载体转染胃癌细胞株SGC7901 胃癌细胞株SCG7901接种于6孔细胞培养板上，常规培养24 h，分别转染上述4种腺病毒液，37℃培养1 h后，加入完全培养基培养72 h，荧光显微镜下观察，以不引起明显细胞病变效应(CPE)的最大MOI作为最佳MOI值，并以最佳MOI值再次进行转染。

1.2.2 RT-PCR测定转染NRP2-shRNA沉默效率 细胞转染72 h后，根据TRizol法提取总RNA，电泳验证。按照按照RTPCR二步法试剂盒说明书进行操作，之后进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶成像系统统计各条带OD值，计算沉默效率，筛选出效率较高的片段。实验重复三次取平均值。

1.2.3 MTT法测定细胞增殖情况 胃癌细胞SGC7901处于对数生长期时制成细胞悬液，以密度为1×104/孔接种到96孔板，37℃、5%CO2浓度常规培养，待细胞贴壁后，分别加入含上述效率最高的NRP2-shRNA腺病毒液的培养基和空白培养液，于转染后72 h加入5 mg/ml的MTT溶液每孔10 ml，温箱孵育4 h后弃上清，每孔加入DMSO 150μl震荡10 min，使结晶充分溶解后用酶标仪测定490 nm波长的OD值，以无细胞的空白孔调零，实验重复三次取平均值。

1.2.4 Western印迹测定SGC7901细胞转染后NRP2蛋白表达效率 取转染腺病毒72 h的SGC7901细胞，4℃预冷的PBS冲洗3次后加入含1%PMSF的裂解液400μl，置于冰上裂解30 min，4℃离心12 000 r/min×5 min，取上清。采用BCA法计算蛋白浓度。蛋白与上样缓冲液以 3∶1比例混合，加入10μl/mlβ-巯基乙醇，煮沸5 min。配置8%分离胶、5%浓缩胶后进行SDS-PAGE电泳后，转膜至PVDF膜上，放置保鲜袋内加入1∶500稀释浓度的一抗4℃过夜，加入二抗室温孵育1 h，用TBST洗涤PVDF膜，BCIP/NBT染色工作液进行显色反应，凝胶成像系统分析目的条带及内参照，实验重复三次取平均OD值。

1.3 统计学方法 数据用SPSS17.0软件包进行统计学处理，计量资料用x±s表示，采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 腺病毒液转染胃癌细胞株SGC7901情况 胃癌细胞株SGC7901正常培养生长汇合至70%可见细胞成梭形贴壁生长，分布均匀，胞浆饱满;经腺病毒介导的NRP2-shRNA沉默片段转染SGC7901 72 h后发现有大量绿色荧光表达而未见明显CPE现象。见图1。

图1 SCG7901细胞生长情况

2.2 RT-PCR检测结果 转染腺病毒液72 h后RT-PCR产物电泳结果显示各组内参β-actin条带亮度相似，各重组腺病毒转染组NRP2 mRNA水平低于阴性转染组和空白对照组(图2)，3种病毒液与阴性对照和空白对照组相比均存在显著性差异(P＜0.05)，表明3种病毒液均不同程度下调NRP2基因mRNA的表达，其中以载体NRP2-shRNA-3(C组)抑制效应最强，与A组和B组相比，有显著性差异(P＜0.05)。见表2。

表2 各组NRP2 mRNA相对OD值表达情况(x ± s，n=3)

2.3 MTT检测SGC7901细胞增殖情况 阴性对照组与空白组细胞生长迅速，两组间无显著差异(P＞0.05)，实验组(C组)经腺病毒载体转染后细胞增殖程度显著减少，与前两组相比有显著性差异(P＜0.05)。见表3。

表3 MTT法检测三组细胞不同时间点的OD值

图2 RT-PCR检测各组NRP2 mRNA表达情况

2.4 Western印迹测定NRP2蛋白表达量 阴性对照组(D组)与空白组(E组)NRP2蛋白相对OD值分别为0.77±0.15和0.82±0.10，明显高于实验组(C组)的0.14±0.01，有显著性差异(P＜0.01)，而D组与E组之间无显著性差异(图3，P ＞0.05)。

图3 Western印迹检测各组NRP2蛋白表达情况

3 讨论

NRPs是一种跨膜糖蛋白，最初是作为轴突导向分子Semaphorin的受体而发现，在神经细胞的导向中发挥重要调节作用，进一步研究证明NRP2在血管的生成、发育及肿瘤的生长转移中也起着关键的作用〔5，6〕，给我们胃癌的基因治疗方面提供了新的思路。

在本项实验中我们选取SGC7901细胞作为实验的研究对象。采用RNAi干扰技术抑制胃癌细胞SGC7901 NRP2基因的表达。由于siRNA在体内的半衰期短，对基因的抑制作用较短暂，为了能够较长时间抑制NRP2基因，我们采用构建shRNA腺病毒表达载体来沉默NRP2基因，重组载体转染进细胞后通过RNA聚合酶Ⅲ启动子转录互补DNA序列，从而在体内合成shRNA，合成的shRNA在Dicer酶的作用下环状区域断裂形成双链siRNA，进而产生干扰效应。由于shRNA腺病毒表达载体可在体内持续产生siRNA，因此，可达到长时间沉默NRP2基因的作用。另外，本实验通过阻断SGC7901细胞中NRP2基因的作用抑制了癌细胞的增殖生长和淋巴转移。在实验中我们通过RT-PCR、MTT、Western印迹方法分别检测了SGC7901细胞中NRP2基因的mRNA和蛋白的表达情况以及癌细胞增殖情况，结果表明携带有GFP的腺病毒表达载体转染胃癌细胞SGC7901成功，且转染效率较高，重组腺病毒载体转染胃癌细胞SGC7901导致NRP2基因的mRNA和蛋白表达降低，说明腺病毒载体可以抑制胃癌细胞SGC7901中的NRP2基因的mRNA表达及转录后的蛋白表达，NRP2-shRNA腺病毒载体具有抑制SGC7901细胞增殖的作用。

综上所述，我们成功的利用重组腺病毒载体抑制了NRP2基因在胃癌细胞SGC7901中的表达，为下一步动物模型体内实验提供理论基础和前期准备。

1 陈 凉，李 涛.胃癌综合治疗现状与进展〔J〕.世界华人消化杂志，2008;16(6):571-4.

2 Quante M，Raskopf E，Stahl S，et al.No functional and transductional significance of specific neuropilin 1 siRNA inhibition in colon carcinoma cell lines lacking VEGF receptor 2〔J〕.Oncol Rep，2009;21(5):1161-8.

3 Geretti E，van Meeteren LA，Shimizu A，et al.A mutated soluble neuropilin-2 B domain antagonizes vascular endothelial growth factor bioactivity and inhibits tumor progression〔J〕.Mol Cancer Res，2010;8(8):1063-73.

4 Rizzolio S，Tamagnone L.Multifaceted role of neuropilins in cancer〔J〕.Curr Med Chem，2011;18(23):356375.

5 Caunt M，Mak J，Liang WC，et al.Blocking neuropilin-2 function inhibits tumor cell metastasis〔J〕.Cancer Cell，2008;13(4):331-42.

6 Cai Y，Wang R，Zhao YF，et al.Expression of Neuropilin-2 in salivary adenoid cystic carcinoma:its implication in tumor progression and angiogenesis〔J〕.Pathol Res Pract，2010;206(12):793-9.