史美龙

(吉林省人民医院基本外科，吉林 长春 130021)

Survivin基因属于凋亡抑制基因家族，Survivin蛋白在人结肠癌组织以及细胞株中均显著高表达，与结直肠癌的发生发展、侵袭转移及血管形成有关，已成为具有潜在价值的肿瘤生物学标志物和肿瘤治疗的新靶点〔1，2〕。本课题前期构建了靶向干扰Survivin的小发卡RNA(shRNA)，并对Survivin基因沉默后结直肠癌的生物学行为进行了评价，发现其能够明显抑制结直肠癌细胞增殖〔3，4〕。在前期研究工作的基础上，本研究利用已经构建成功的重组载体，探讨Survivin基因沉默后垂体瘤转化基因(PTTG)mRNA的表达，旨在为阐明Survivin在结肠癌发生发展中的作用及基因治疗的应用方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 结直肠癌Lovo细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所。RPMI1640培养基购自Gibco公司，转染试剂脂质体lipo2000购自Invitrogen公司，质粒小提试剂盒购自Promega公司。重组质粒pGenesil-2-对照(非同源干扰序列插入pGenesil-2)和pGenesil-2-Survivin 1(插入靶向Survivin基因5'-GGACCACCG CATCTCTACA-3'目的片段干扰序列的pGenesil-2干扰载体)以及pGenesil-2-Survivin 2(插入靶向Survivin基因5'-GGCTGGCTTCATCCACTGC-3'目的片段干扰序列的pGenesil-2干扰载体)由本实验室构建。

1.2 质粒抽提 将本实验构建的重组质粒pGenesil-2-对照、pGenesil-2-Survivin 1和pGenesil-2-Survivin 2接种于50 ml LB培养液中，37℃、250 r/min振摇培养16 h。运用质粒抽提试剂盒抽提质粒DNA，按照试剂盒说明书进行。

1.3 细胞转染 运用含10%胎牛血清在37℃、5%CO2培养箱中培养Lovo细胞。将细胞接种于6孔板中，接种密度约为5×105个/孔。运用脂质体Lipo 2000转染重组质粒pGenesil-2-对照、pGenesil-2-Survivin 1 和 pGenesil-2-Survivin 2，转染方法按照Lipo2000说明书进行。

1.4 实时荧光定量PCR 于转染后0、24、48和72 h收集细胞，运用Trizol法按照操作说明书提取总RNA(购自北京百泰克生物科技有限公司)，运用反转录试剂盒(购自Fermentas公司)逆转录为cDNA，-20℃保存。……