张清华 艾 民 蒋知新 沙 杭 高 毅 卢 海

(中国人民解放军三零五医院，北京 100017)

胚胎干细胞(ESCs)是具有无限增殖，自我更新和多向分化潜能的一种未分化细胞，在体外可被诱导分化为神经细胞〔1〕、平滑肌细胞、心肌细胞〔2〕、造血细胞〔3〕而用于多种疾病的治疗，具有广阔的研究和临床应用前景。目前，ESCs研究也存在着一些问题，如免疫排斥反应和伦理学问题的争论。诱导多潜能干细胞技术是将多能性基因转染到已分化的体细胞，将其重编程为类似于ESCs的多潜能干细胞，并被命名为“诱导多潜能干细胞”(iPSCs)，简称“iPS细胞”〔4〕。iPS细胞回避了 ESCs免疫排斥反应和伦理学的争论问题，近年来成为干细胞领域的研究热点。本实验拟采用包装生产携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞(HSF)，判断逆转录病毒对HSF细胞的感染情况，为下一步HSF细胞重编程实验提供技术保证。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂 皮肤标本来源于南方医科大学第二临床学院，经患者及其家属同意签字后方可取标本。高糖型DMEM、10%FBS、PBS、明胶、pMX-GFP、pCL 包装质粒、polybrene、磷酸钙转染用试剂盒。

1.2 原代培养HSF细胞〔5〕手术取患者上臂内侧至真皮层2 cm×2 cm皮肤组织标本，用PBS将组织标本清洗3遍后剪碎至1 mm×2 mm左右，将其平铺到包被明胶的培养皿中，添加HSF细胞培养基(高糖型DMEM+10%FBS)，置于37℃ 5%CO2培养箱培养，每天更换HSF细胞培养基。

1.3 包装生产逆转录病毒 采用磷酸钙转染法将GFP基因转染到293T细胞内，具体步骤如下:先加水，再加pMX-GFP和pCL包装质粒混匀。向混合液中加入2 mol/L CaCl2颠倒混匀。……