白美玲 张林西 李海军 郝秀轻

(河北北方学院基础医学院病理教研室，河北 张家口 075000)

我国是世界上食管癌的高发国家之一，部分患者早期症状不典型，就诊时多为中晚期，血行播散是导致食管癌患者最终死亡的重要因素。近年来肿瘤抗血管生成治疗得到广泛关注，但肿瘤血管生成的机制尚不明确。本研究采用S-P免疫组化方法检测97例食管鳞癌组织中血管生成素-2(Ang-2)、环氧合酶-2(COX-2)及CD105抗体标记的微血管密度(MVD)来阐述肿瘤血管生成机制，同时结合随访资料判断三者的表达与患者预后的关系，以便寻求新的生物治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 临床病理资料 收集河北北方学院附属第一医院1997年1月至2000年12月住院患者中临床病理资料齐全的食管鳞

状细胞癌97例，男85例，女12例;年龄42～79岁，平均60岁;癌组织侵及食管黏膜及黏膜下层18例，侵及肌层40例，侵及浆膜或浆膜外39例;无淋巴结转移59例，有淋巴结转移38例;根据国际抗癌联盟(UICC)的TNM分期标准进行临床分期:Ⅰ期18例，Ⅱ期43例，Ⅲ期30例，Ⅳ期6例;高分化鳞癌28例，中分化鳞癌46例，低分化鳞癌23例。另选取12例切缘正常食管组织作为对照。97例患者全部通过信件及电话沟通随访，随访截止日期2011年1月1日，共12例死亡，随访时间为3～120个月，中位随访时间为53个月，失访6例。

1.2 免疫组织化学试剂及步骤 兔抗人Ang-2多克隆抗体(克隆号BA1530，工作浓度1∶100)为武汉博士德生物工程有限公司产品;兔抗人COX-2单克隆抗体(克隆号ZA-0515，即用型)、鼠抗人CD105单克隆抗体(克隆号ZM-0297，即用型)SP试剂盒和DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用SP法进行常规免疫组化染色，具体步骤按试剂盒说明书操作，用PBS代替一抗作为阴性对照，阳性对照片由试剂公司提供。采用双盲法，由两位资深病理医师对切片进行阅片及诊断，Ang-2与COX-2均以肿瘤细胞胞浆出现浅黄色到深棕色颗粒为阳性细胞，以综合染色强度和阳性细胞所占的百分比作为评价标准。

1.3 MVD计数 CD105标记MVD，其阳性以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为标准。在低倍镜下(200倍)寻找整张切片中富含血管组织的“热点”区，即棕黄染色密度最高的区域，该区域必须要位于癌组织内部或与癌组织相连。然后在高倍镜下(400倍)计数其中的血管数目。

1.4 统计学处理 用SPSS13.0统计软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验。各指标表达水平与临床病理参数之间作直线回归相关分析，对有预后价值的指标作Kaplan-Meier生存曲线，组间差异比较用Log-rank检验。

2 结果

2.1 Ang-2和COX-2在切缘正常组织与癌组织的表达情况Ang-2和COX-2阳性均定位于肿瘤细胞胞质内，食管鳞癌组织Ang-2表达阳性率为69.07%(67/97)显著高于癌旁正常组织Ang-2表达阳性率〔33.33%(4/12)，P＜0.05〕;食管鳞癌组织COX-2表达阳性率为77.32%(75/97)显著高于切缘正常组织〔41.67%(5/12)，P ＜0.05〕。

2.2 Ang-2和COX-2的表达与临床病理参数的关系 食管鳞癌组织中Ang-2的阳性表达和癌组织浸润程度、淋巴结转移及临床分期有关(P＜0.05)，即随着癌细胞浸润越深、出现淋巴结转移、分期越晚时Ang-2表达会增高。而COX-2的表达水平与癌组织分化程度、淋巴结转移及临床分期有关(P＜0.05)，即随着分化程度越低、出现淋巴结转移、分期越晚时COX-2表达率升高。见表1。

2.3 Ang-2与COX-2的关系 在食管鳞癌中Ang-2和COX-2表达变化的趋势一致:两者表达均上调(r=0.39，P=0.028)。

2.4 Ang-2和COX-2与MVD的关系 CD105标记的MVD在67例Ang-2阳性表达食管鳞癌组织中表达为53例，MVD计数为22.17±3.07;CD105标记的MVD在23例Ang-2阴性表达食管鳞癌组织中表达为21例，MVD计数为28.41±3.60，Spearman秩相关分析结果，Ang-2表达与MVD呈正相关(r=0.795 4，P＜0.05)。CD105标记的 MVD在75例COX-2阳性表达食管鳞癌组织中表达为43例，MVD计数为20.12±2.02，CD105标记的MVD在22例COX-2阴性表达食管鳞癌组织中阳性表达仅为7例，MVD计数为26.61±3.51，Spearman秩相关分析结果，COX-2表达与 MVD呈正相关(r=0.853 8，P＜0.05)。

表1 Ang-2和COX-2阳性表达与食管鳞癌各临床病理参数间的关系〔n(%)〕

2.5 Ang-2和COX-2的表达与患者术后生存率的关系 通过对食管癌患者随访资料的分析可以看出，Ang-2表达阳性的患者10年生存率(12%)明显低于Ang-2阴性患者生存率(26%)。另经统计学分析，COX-2阳性表达的食管癌患者10年生存率(10%)显著低于COX-2阴性患者的生存率(31%)。

3 讨论

促血管生成因子中以Ang-2的作用最强;COX-2的高表达则可促进肿瘤新生血管的形成，是调控肿瘤血管形成的重要因素之一;而肿瘤内MVD最能代表血管新生强度。故同时检测这三种生物学指标对于评定食管癌恶性程度、制定个体化的治疗方案及评估预后具有重要意义。

已有研究表明，Ang-2在诱导多种肿瘤血管形成中起着重要的作用，且随着 Ang-2表达的上调，患者的预后越差〔1～3〕。我们的前期研究中也已发现Ang-2在诱导肿瘤血管形成中起着重要的作用〔4〕，而在本研究中也看到了Ang-2在食管鳞癌组织中高表达同时伴有微血管密度增高、成熟度下降，患者临床TNM分期晚，术后生存率低。这表明Ang-2不仅在诱导食管癌血管形成中起着重要的作用，而且其的高表达可作为评价食管癌患者预后的一项独立的指标。

COX-2在细胞凋亡和肿瘤发生中起一定作用。COX-2在正常组织中几乎不表达，但是在特殊因子刺激下可高表达于多种肿瘤组织中，并具有促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡、促进新生血管形成、调节肿瘤免疫等多方面的功能〔5〕，其中促进肿瘤血管生成的作用近年来倍受学者重视。本研究提示COX-2在食管癌中的表达不仅增加肿瘤组织的侵袭力，而且诱导宿主微血管形成，为其快速生长和远处转移提供条件。

Takatori等〔6〕研究认为新辅助放化疗后COX-2的表达水平与食管癌复发率显著相关，可作为食管癌预后因子。而在我们的随访资料中也看到，随着COX-2阳性表达率的上升，患者的生存率下降，这进一步表明COX-2的表达可作为食管癌患者一项独立的预后指标，因此该指标的检测对食管癌患者术后临床用药的指导和预后的判断尤其重要。国外有报道〔7〕，COX-2可以促进肿瘤细胞诱导Ang-2及其受体的产生，从而促进肿瘤血管生成。本次研究结果表明COX-2与Ang-2在食管癌表达异常增高，且两者均呈阳性表达的区域较单一阳性表达的区域血管密集，可能机制为COX-2间接上调内皮细胞Ang-2的表达或促进食管癌细胞诱导Ang-2的生成来增加食管癌血管的生成，但是具体作用机制还不太明确，仍需要进一步研究证实。总之，两者在肿瘤的形成、浸润、扩散等过程中都发挥着重要作用，可以作为判断食管癌生物学行为和预后的重要指标。

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4 白美玲，张 凡，张林西，等.Ang-2和Tie-2在食管鳞癌患者肿瘤组织中的表达及意义〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(15):2226-7.

5 Ozuysal S，Bilgin T，Ozgur T.Expression of cyclooxygenase-2 in ovarian serous carcinoma:correlation with angiogenesis，nm23 expression and survival〔J〕.Eur J Gynaecol Oncol，2009;30(6):640-5.

6 Takatori H，Natsugoe S，Okumura H，et al.Cyclooxygenase-2 expression is related to prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Eur J Surg Oncol，2008;34(4):397-402.

7 Coffelt SB，Tal AO，Scholz A.Angiopoietin-2 regulates gene expression in tie-2-expressing monocytes and augments their inherent proangiogenic functions〔J〕.Cancer Res，2010;70(13):5270-80.