张宏瑞 ，郑永杰 ，田景芝

（1.齐齐哈尔大学 化学与化学工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔市质量检测中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O是芳香胺类工业染料，主要用于纺织品、皮革制品及木制品的染色[1]。由于碱性橙比柠檬黄和日落黄等水溶性染料更易于在豆腐、糕点、鲜海鱼上着色且不易褪色，因此，一些不法商贩用碱性橙Ⅱ对这类食品进行染色[2，3]。有报道指出，过量吸入、摄取或皮肤接触碱性橙Ⅱ可造成急性和慢性的中毒，而且相关的动物实验表明碱性橙为致癌物[4-6]。中华人民共和国食品添加剂使用卫生标准（GB2760）规定,碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O禁止用作食品添加剂[7，8]。

目前，没有碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O检测方法的国标。其检测最常采用的分析方法是高效液相色谱法[1，6，9]。许多文献报道了使用高效液相色谱（HPLC）对豆制品、辣椒粉及黄鱼中的碱性橙Ⅱ的分析方法[4，5，10]，但是对蛋糕中碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄 O 进行检测的方法较少。本实验是对HPLC检测蛋糕中碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O的前处理方法进行优化，通过对乙腈提取、正己烷脱脂、乙醚萃取的前处理方法进行优化，确定了HPLC检测蛋糕中碱性橙含量的较佳的前处理方法。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

标准品为Sigma公司的碱性橙标样，其中包括碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O。

甲醇（色谱纯）；正己烷、乙酸铵、H3PO4、Na2SO4、乙腈、NH3·H2O、NaCl、乙醚（分析纯）等。

Ag ilent高效液相色谱仪；二极管阵列检测器；氮吹仪；旋涡振荡器；离心机；超声清洗器等。

1.2 样品前处理方法

方法一：有机溶剂萃取

称取10.0g蛋糕样品，每10.0g样品中碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O的加标量分别10.0mg和15.0mg，粉碎后放入125mL具塞锥形瓶中，加入乙腈和4g无水硫酸钠后摇匀，并对其进行超声提取。将上清液离心（3500r·min-1，15min）。取 5.0mL提取液于 20mL试管中,用3mL正己烷涡旋萃取4次，弃去正己烷层，将其放入40℃水浴中，用氮气吹至近干。加入2mL 2%的氨水和0.5g氯化钠，用无水乙醚萃取3次，收集乙醚提取液，用氮气吹干,用流动相溶解后定容到2.0mL。用0.22μm滤膜过滤后待测。

方法二：使用固相萃取柱萃取

称取8～10g均质后样品,每10.0g样品中碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O的加标量分别10.0mg和15.0mg。加入15mL甲醇，摇匀后超声提取30min。以8000r·min-1离心10min，收集上层清液。用少量甲醇提取残渣2次。合并提取液，在氮吹仪上吹干，加入1mL正己烷溶解。中性氧化铝SPE小柱分别用2mL甲醇和正己烷预洗后上样，使用20mL正己烷淋洗，使洗脱液变为无色，用2mL 80%的甲醇淋脱，收集淋洗液，定容至5mL，经0.22μm滤膜过滤后，进高效液相色谱仪进行测定。

1.3 色谱分析条件

色谱柱为 XDB-C18（5μm，4.6mm×150mm）；柱温为30℃;检测波长为452nm，对比波长为650nm；进样量为 20μL；流速：1.0mL·min-1。流动相为甲醇和0.02mol·L-1乙酸胺溶液。梯度洗脱条件：0～10min甲醇与乙酸胺溶液比例由（50∶50）洗脱到（80∶20）；10～15min 甲醇与乙酸胺溶液比例为（80∶20）；15～18min 甲醇与乙酸胺溶液比例由（80∶20）洗脱到（50∶50）。

1.4 数据处理

所有数据经Excel（2003）初步整理后，采用SPSS（11.5）软件进行统计分析，并用LSD法进行多重比较，数据均为平均数±标准差（X±SD）。

2 结果与分析

2.1 前处理中乙腈的使用量对样品测量结果准确性的影响

图1是标样以及加标样品的色谱图。

图1 （1）标准样品谱图；（2）加标后样品的谱图Fig.1 （1）Chromatogram of standard sample（2）Chromatogram of sample added sample

表1是方法一中乙腈使用量对碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O加标回收率的影响，超声时间为40min，乙醚使用量为每次3mL。

表1 乙腈使用量对碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O的加标回收率（%）的影响Tab.1 Effect of volume of acetonitrile on the recovery rate of chrysoidin and auramine O

由表1可以看出，乙腈使用量为40mL时碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O的加标回收率最高，乙腈使用量小于30mL时，其加标回收率随着乙腈使用量的增加而显著增加。有报道指出乙腈具有很好的渗透性,对样品中的色素提取完全且所含的干扰杂质较少[8]。其他前处理条件不变，使用35mL乙醇代替乙腈时，碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O的加标回收率分别为68.42%和71.53%，显著低于使用乙腈时的加标回收率，88.61%和87.01%。所以，乙腈更适合用于对碱性橙的提取。

2.2 前处理中超声时间对样品测量结果准确性的影响

表2是方法一中超声时间对碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O加标回收率的影响，其中超声时间如表所示，乙腈使用量为35mL，乙醚使用量为每次3mL。

表2 超声时间对碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O的加标回收率（%）的影响Tab.2 Effectof the time of ultrasonic on the recovery rate of chrysoidin and auramine O

由表2可以看出，超声时间小于50min时，碱性橙加标回收率随着超声时间的增加而显著增加；超声时间小于30min时碱性嫩黄O加标回收率随着超声时间的增加而显著增加。其中超声时间为50min时碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O的加标回收率最高。

2.3 前处理中乙醚使用量对样品测量结果准确性的影响

方法一中使用正已烷脱脂后，使用乙醚对碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O进行3次萃取。表3是乙醚使用量对其加标回收率的影响，其中乙醚的使用量如表所示，乙腈使用量为每次35mL，超声时间为40min。

表3 乙醚使用量对碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O的加标回收率（%）的影响Tab.3 Effectof volume of aether on the recovery rate of chrysoidin and auramine O

由表3可以看出，乙醚使用量为3.0mL时碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O的加标回收率最高。有报道指出乙醚对碱性橙的溶解力较强，所以乙醚的使用量对加标回收率的影响不大[8，10]。这与本实验结果是一致的。

2.4 两种前处理方法对比

方法一是使用有机溶剂对碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O进行萃取，方法二是使用固相萃取柱对碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O进行萃取。本实验是对两种前处理方法进行比较，其中方法一中的乙腈使用量为每次35mL，超声时间为40min，乙醚使用量为每次3mL。结果表明，使用有机溶剂萃取法后的碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O加标回收率分别为88.61±0.64%和87.01±1.54%。使用固相萃取法后其加标回收率分别为81.20±0.82%和 80.01±1.73%（P＜0.05），这两种前处理方法对加标回收率影响的差异不显著（P＞0.05）。

3 结论

对碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O进行液相色谱分析时，使用有机溶剂提取法和固相萃取法做液相前处理时，碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O的加标回收率都比较高，由于固相萃取柱的价格比较昂贵，因此，前处理时可以使用有机溶剂提取法代替固相萃取法。使用有机溶剂提取法的最佳条件为乙腈使用量为每次35mL，超声时间为40min，乙醚使用量为3.0mL。碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O的加标回收率达到88.61%和87.01%。

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