方红波，张水军#，张 明，郭文治，张建军，赵永福

1)郑州大学第一附属医院肝胆胰外科;河南省肝移植中心;河南省高等学校肝胆胰外科与消化器官移植重点学科开放实验室郑州450052 2)上海交通大学附属仁济医院器官移植中心上海200127

胆管梗阻性黄疸是肝胆外科常见症状，可见于胆总管结石、胆管癌、胰头癌等疾病。若梗阻得不到及时解除，可引发急性肝功能衰竭、胆汁性肝硬化等。约8%的梗阻性黄疸患者在围手术期发生急性肾功能衰竭，发生急性肾功能衰竭后约68%的患者死亡［1］。缺血再灌注损伤可诱导急性肾功能衰竭。以往的研究［2-4］多关注于胆管梗阻对肝脏的影响，作者建立小鼠胆总管短暂梗阻(transient common bile duct obstrnction，TCBDO)模型和肾脏缺血再灌注(kidney ischemia-reperfusion，KIR)模型，观察 TCBDO对肾脏和KIR的影响。

1 材料与方法

1.1 TCBDO模型的制备 用60 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射诱导麻醉小鼠，腹正中切口打开腹腔，暴露出肝门，用7-0带针线缝扎胆囊管，并在胰腺上方打一活结，结扎胆总管，将松线端埋于皮下，双层关腹。术后第2天将结扎线松开。胆总管结扎假手术(SHAM)不结扎胆总管，其余操作步骤同上。

1.2 KIR模型的制备 用60 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射诱导麻醉，将小鼠置于动物恒温系统的加热板上，置温度感应探头于肛门，维持体温(36.0±0.5)℃。腹正中切口打开腹腔，将右侧肾脏切除，游离出左侧肾蒂，腹腔注射肝素钠50 U/kg，用无损失微血管夹夹闭肾蒂25 min后，移去血管夹，然后双层关腹，皮下注射0.5 mL生理盐水，24 h后取血和肾标本。

1.3TCBDO后小鼠血清总胆红素(TB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和肌酐(Cr)水平的变化 取清洁级C57BL/6雄性小鼠30只，年龄8～12周，体质量20～28 g，自由进食水，制备TCBDO模型，术后第0、1、2、3、4 及 5 天，腹主动脉抽血约1 mL，分离血清测TB、ALT和Cr;并于术后第3、4及5天，取肾脏测HSP27蛋白的表达。每个时间点5只小鼠。以SHAM后第4天小鼠为对照。

1.4 TCBDO对小鼠KIR影响的观察 另取40只小鼠，将按随机数字表法分为4组，每组10只。SHAM+NOIR组:行SHAM且不做 KIR，于 SHAM后第4天抽血留标本;TCBDO+NOIR组:行TCBDO造模术不做KIR，第4天抽血留标本;SHAM+KIR组:行SHAM术后第4天行KIR造模术，缺血25 min灌注24 h后抽血留标本;TCBDO+KIR组:TCBDO造模术后第4天行KIR术，缺血25 min再灌注24 h后抽血留标本。血标本用于血清Cr水平测定。抽血后切取肾脏，用于HSP27蛋白、组织形态学、中性粒细胞浸润程度和细胞凋亡检测。

1.5 指标观测方法

1.5.1 血清生化指标测定 采用西门子德灵自动生化仪测血清TB、ALT及Cr。

1.5.2 肾脏HSP27的表达 肾脏留取后冻存。用NE-PER核和胞质蛋白提取试剂(Thermo Scientific)提取总蛋白，使用100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，封闭后加兔抗鼠HSP27多克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)、抗β-actin小鼠单克隆抗体(碧云天生物技术公司)，二抗为抗兔、抗鼠多克隆抗体(Licor公司)。以目的蛋白与β-actin条带光密度的比值为目的蛋白的相对表达量。

1.5.3 肾脏组织形态学观察 肾脏标本于中性甲醛中过夜，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，5 μm厚切片，行过碘酸雪夫(PAS)染色。以半定量组织病理评分评估肾组织变化:正常为0分;异常变化＜25%计为1分;异常变化占25% ～为2分;50% ～为3分;75%～为4分。每个切片至少观察3个视野(×400)。

1.5.4 肾脏中性粒细胞浸润程度测定 采用髓过氧化物酶(MPO)法检测。试剂购自Novus Biologicals公司。阳性细胞有棕黄色颗粒。每个切片至少观察3个无重叠视野(×400)，根据阳性细胞计数的平均值评估中性粒细胞浸润程度。

1.5.5 肾脏细胞凋亡测定 采用TUNEL法检测，试剂购自Chemicon International公司。凋亡细胞呈棕褐色。每个切片至少观察3个无重叠视野(×400)，计数凋亡细胞，以平均值评估细胞凋亡程度。

1.6 统计学处理 采用SPSS 10.0处理数据，不同时间点TCBDO小鼠血清 TB、Cr、ALT及 HSP27蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析及LSD-t检验;4组小鼠肾组织病理评分和MPO阳性细胞数的比较采用非正态分布数据Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney检验，采用析因设计的方差分析比较4组小鼠血清Cr水平及肾组织凋亡细胞数;检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1TCBDO 后小鼠血清 TB、ALT、Cr水平的变化TCBDO后各时间点小鼠血清TB、ALT、Cr测定结果见表1。可以看出，TCBDO后小鼠血清TB和ALT水平快速上升，此后迅速降低;血清Cr水平变化不大。

表1 TCBDO后小鼠血清TB、Cr、ALT的水平

2.2 TCBDO后小鼠肾脏HSP27蛋白的表达TCBDO后小鼠肾脏HSP27蛋白表达增强，见图1和表2。

图1 TCBDO后小鼠肾脏HSP27蛋白的表达

表2 TCBDO后小鼠肾脏HSP27蛋白的表达

2.3 TCBDO对小鼠KIR后血清Cr水平的影响见表3。

表3 TCBDO+KIR对小鼠血清Cr水平的影响(n=10)

2.4 TCBDO对小鼠KIR后肾组织的影响 见图2。SHAM+KIR组:高倍镜下可见广泛的肾小管上皮细胞坏死，有炎症细胞浸润，腔内可见管型和坏死脱落的细胞，肾间质血管高度扩张充血，可见灶性出血，肾组织病理评分为(3.20 ±0.58)。TCBDO+KIR组:损伤程度减轻，大片坏死区明显减少，仅见局灶性小管坏死，很少见管型和坏死细胞，间质充血、出血明显减轻，肾组织病理评分为(2.10±0.52)。SHAM+NOIR组和TCBDO+NOIR组肾组织表现正常，肾组织病理评分均为(0.00±0.00)。4组肾组织病理评分差异有统计学意义(H=14.545，P=0.002)，TCBDD+KIR 组较 SHAM+KIR组明显降低。

图2 4组小鼠肾脏组织学表现(PAS染色，×400)

2.5 TCBDO对小鼠KIR后肾组织中性粒细胞浸润的影响 MPO染色结果见图3。SHAM+NOIR和TCBDO+NOIR组MPO阳性细胞数均为(0.00±0.00)，SHAM+KIR 和 TCBDO+KIR 组分别为(42.0 ±11.0)和(15.0 ±5.0)，4 组间比较，差异有统计学意义(H=14.545，P=0.002)，TCBDO+KIR组较SHAM+KIR组明显降低。

图3 4组小鼠肾组织中性粒细胞浸润情况(MPO染色，×400)

2.6 TCBDO对小鼠KIR后肾组织细胞凋亡的影 响 结果见图4和表4。

图4 4组小鼠肾组织细胞凋亡情况(TUNEL染色，×400)

表4 TCBDO+KIR对小鼠肾组织细胞凋亡的影响

3 讨论

胆总管梗阻可引起血清胆红素升高。大量数据证实，胆红素具有抗氧化和保护细胞的作用。微量的胆红素可以减轻大鼠离体心脏的缺血再灌注损伤［4］。用胆红素冲洗大鼠移植肝脏，能改善移植后肝脏的急性氧化应激和肝胆管功能障碍［5］。在内皮细胞中，胆红素还可以抑制肿瘤坏死因子α激活核因子κB和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达［6］。该实验中，小鼠胆总管短暂梗阻(TCBDO)术后血清TB、ALT水平先快速升高，后迅速下降，至术后第4天已降到正常水平;而血清Cr水平未发生明显变化。因而，该实验中，作者选择在TCBDO术后第4天行KIR造模术，因此可忽略血清胆红素对实验结果的影响。

KIR损伤的一个重要特征就是中性粒细胞的聚集和浸润;中性粒细胞通过ICAM-1和P-选择素连接于血管内皮细胞，透过内皮细胞间隙游走到肾脏组织间隙;中性粒细胞产生和释放的蛋白酶、细胞因子、活性氧和氮化物可对肾组织产生损伤［7］。该研究结果显示，TCBDO后第4天行KIR，小鼠血清Cr水平、肾组织病理评分和中性粒细胞浸润程度较单独KIR术后明显降低，同时细胞凋亡也明显减少，说明TCBDO可减轻小鼠KIR损伤。HSP27是小分子热休克蛋白，可由缺氧、缺血、高温等各种应激因素诱导而高表达，以抵御应激造成的伤害。HSP27具有分子伴侣、抗细胞凋亡、抗氧化应激和抗炎的作用［8］。HSP27高表达的小鼠能更好地耐受肾脏、肝脏和心脏的缺血再灌注损伤［9-11］。该实验中，作者发现，TCBDO后小鼠肾脏HSP27蛋白表达明显增强。热应激处理大量诱导的HSP27可阻碍大鼠心脏中血管紧张素Ⅱ诱导的白细胞介素-6(IL-6)和ICAM-1的表达，从而减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心脏炎症反应［12］。HSP27可通过P38-促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)刺激活化单核细胞产生IL-10［13］。IL-10能抑制多种炎症细胞因子的合成和释放，具有减轻KIR损伤的作用［14-15］。根据该研究结果，推测高表达的HSP27可能通过抑制内皮细胞ICAM-1的表达，从而阻碍中性粒细胞的聚集和浸润;通过P38-MAPK途径诱导单核细胞产生IL-10，减轻KIR损伤。

综上所述，TCBDO影响了小鼠肝脏功能，并未影响到肾脏功能，而有可能作为诱导者，增强肾脏HSP27的表达，从而增强了肾脏抵抗伤害的能力。这可为防治梗阻性黄疸患者术后急性肾功能衰竭的发生提供参考，其明确的作用机制有待进一步研究。

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